劉竹楓,王文紅,張瑄,陳文玉
先天性腎性尿崩癥(congenital nephrogenic diabetes insipidus,CNDI)是一組遺傳異質(zhì)性單基因疾病,較少見,約占所有腎性尿崩癥(NDI)的10%,其發(fā)病機制主要是由于垂體后葉素分泌的抗利尿激素(arginine vasopressin,AVP)信號轉(zhuǎn)導途徑缺陷,導致腎小管遠端及集合管對AVP 反應不敏感或無反應。CNDI約90%為抗利尿激素受體2(AVPR2)基因突變所致,該基因為X連鎖隱性遺傳,其余10%由水通道蛋白2(AQP2)基因突變所致,為常染色體顯性或隱性遺傳。近年來,CNDI基因突變的遺傳及分子機制成為該領(lǐng)域的研究熱點,為該病在基因及分子水平上的診斷和治療提供了可能性。AVPR2基因突變導致的X連鎖CNDI的位點在逐漸增加,目前共發(fā)現(xiàn) 280 多 種AVPR2基 因 突 變[1],中 國 發(fā) 現(xiàn) 32 個AVPR2基因位點突變,以錯義突變?yōu)橹鳎?29 個[2]。CNDI 多在嬰兒期發(fā)病,發(fā)病率較低,如臨床醫(yī)師不能充分認識,早期診斷及時治療,會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥,如生長發(fā)育落后,智力低下,腎功能不全,甚至嚴重的電解質(zhì)紊亂導致死亡。本研究報告1例確診為CNDI的患兒,通過臨床資料及基因檢測明確診斷并治療隨訪及文獻復習。
1.1 病例資料 先證者 男,4 月齡。生后24 d 因鼻塞、喉中痰鳴2 d、發(fā)熱5 h,于2018 年1 月31 日入住我院新生兒科病房。體溫波動在39.1~40.5 ℃之間,物理降溫較難降至正常。個人史(即生產(chǎn)史):系第1 胎第1 產(chǎn),足月順產(chǎn),否認宮內(nèi)窘迫及生后窒息史,母親孕期無異常。入院查體:體質(zhì)量3.5 kg,血壓65/45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),體格發(fā)育欠佳,神志清、精神反應可,呼吸平穩(wěn),無浮腫、皮膚彈性尚可,心肺腹查體未見明顯異常,正常男性外生殖器,四肢肌力肌張力正常。血常規(guī):血紅蛋白126 g/L,白細胞計數(shù)11.13×109/L,中性粒細胞計數(shù)(N)0.426,血小板計數(shù)283×109/L;靜脈血氣:酸堿度(pH)7.41,二氧化碳分壓[p(CO2)]34 mmHg,剩余堿(BEb)-2 mmol/L,血C反應蛋白(CRP)、血沉(ESR)正常,3次血培養(yǎng)陰性、3次尿培養(yǎng)陰性。大便細菌培養(yǎng)陰性,病毒培養(yǎng)提示輪狀病毒陽性。血(1,3)-β-D葡聚糖:198.9 ng/L,提示真菌感染。電解質(zhì)多次提示高鈉高氯血癥:血鈉145~157 mmol/L,血氯114~119 mmol/L,肝腎功能大致正常,血肌酐31μmol/L,血尿素氮2.9 mmol/L。胸腹聯(lián)合X線片示雙肺紋理增粗,腹部未見異常。心電圖正常,腹部超聲肝脾腎未見異常。心臟超聲示卵圓孔未閉、房間隔缺損。頭部及垂體核磁顯示雙側(cè)額頂葉腦室旁白質(zhì)區(qū)片狀長T1、稍長T2 信號影,篩竇蝶竇黏膜增厚,垂體平掃未見異常。尿常規(guī):多次尿比重1.000~1.010,鏡檢陰性。診斷:(1)新生兒肺炎。(2)真菌感染。(3)輪狀病毒腸炎。(4)高鈉高氯血癥原因待查。(5)卵圓孔未閉、房間隔缺損。入院后給予抗感染對癥支持治療,患兒體溫有下降趨勢,但高鈉高氯血癥難以糾正。入院后發(fā)現(xiàn)患兒喜飲水,尿量多。監(jiān)測飲水量550~800 mL/d,尿量750~1 050 mL/d,垂體核磁檢查未見異常(圖1A),結(jié)合病史考慮尿崩癥,家屬拒絕禁水-加壓素試驗及基因檢測,自動出院。2018 年 5 月 6 日因間斷發(fā)熱 18 d 第 2 次住院,入住我院腎臟病科。追問病史,患兒自上次出院后仍有多飲、多尿表現(xiàn)。先證者父母非近親婚配,檢測父母尿比重分別為1.020、1.025,除先證者外,患兒父母及其他家族成員否認疑似存在尿崩癥的臨床表現(xiàn)。復查頭部及垂體核磁顯示雙側(cè)額葉、頂葉腦室旁白質(zhì)區(qū)片狀稍長T1、稍長T2信號影較前范圍縮小,垂體蝶鞍不大,垂體形態(tài)未見異常,高度約4.1 mm,垂體后葉短T1 信號消失。垂體柄居中、無增粗。雙側(cè)海綿竇區(qū)未見異常信號影(圖1B)。征得患兒監(jiān)護人知情同意,并簽署知情同意書后行禁水-加壓素試驗(表1),禁水后每小時測尿比重,同時留尿常規(guī)、血液及尿液滲透壓,監(jiān)測6 h,患兒多次尿比重<1.015,尿比重之差<0.001,停止禁水試驗,行加壓素試驗,皮下注射垂體后葉素(0.2 IU/kg),重復上述操作,密切監(jiān)測患兒生命體征,患兒體質(zhì)量降低5%,尿滲透壓<血滲透壓,尿比重<1.015,兩次尿比重之差<0.001,終止試驗。本患兒禁水-加壓素試驗結(jié)果支持腎性尿崩癥。
Fig.1 Pituitary MRI of the child with congenital renal diabetes insipidus圖1 CNDI患兒垂體核磁影像
1.2 基因檢測方法 為明確診斷,先證者及其父母行基因檢測。(1)目標序列捕獲與測序。抽取先證者及其父母靜脈血2 mL,采用德國Qiagen公司QIAamp DNA Blood Midi Kit 按照標準流程提取基因組DNA。利用美國Massachusetts 公司Covaris LE220 超聲波儀將基因組DNA 打斷成主帶為100~500 bp 小片段DNA,然后將打斷后的DNA 片段進行磁珠篩選,篩選后的主片段大小為150~200 bp,末端補平后,在3'端加腺嘌呤(A),使得DNA 片段能與3'端帶有胸腺嘧啶(T)的特殊接頭連接,從而完成單個受檢者的DNA 文庫。Non-Captured樣品進行LM-PCR反應,純化,利用定制的基因片段捕獲探針(Roche NimbleGen,Madison,USA),與10~20個標記好的患者DNA文庫47 ℃雜交16~24 h,雜交結(jié)束后進行探針的洗滌和洗脫反應,隨后進行Captured 樣品的LM-PCR 反應。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和BMG 進行片段大小、濃度檢測,合格后將需要不同數(shù)據(jù)量的文庫進行pooling、定量;然后將pooling 文庫進行單鏈環(huán)化。環(huán)化后的文庫經(jīng)過make DNB 后利用高通量測序儀BGISEQ-500 連續(xù)雙向測序50個循環(huán),并讀出原始測序數(shù)據(jù)。(2)序列分析。數(shù)據(jù)下機后進入信息分析部分。首先對下機的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進行測序質(zhì)量評估,去除低質(zhì)量以及被接頭污染的reads。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)與HG19/HG20進行序列比對,與此同時進行序列捕獲效果評價,用GATK 軟件進行 SNV(single nucletide variant)和 Indel(insertion and deletion)的查詢,生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果,隨后進行數(shù)據(jù)庫(NCBI dbSNP,HapMap,1 000 human genome dataset 和database of 100 Chinese healthy adults)的比對,并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。(3)Sanger法測序驗證。對于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變,在其所在片段上下游設(shè)計引物。進行PCR擴增,對產(chǎn)物做Sanger 測序,從而驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結(jié)果。
Tab.1 The results of water deprivation vasopressin test of the child表1 患兒禁水-加壓素試驗結(jié)果
1.3 基因檢測結(jié)果 先證者AVPR2基因亞區(qū)發(fā)現(xiàn)1 處新發(fā)突變:c.359T>G,為半合子突變,突變類型為錯義突變,導致氨基酸改變:p.Met120Arg,該基因位于X染色體上,先證者母親在AVPR2同樣的基因位點存在新發(fā)突變:c.359T>G,為雜合突變,與先證者突變序列相同,受檢者父親無此突變,見圖2。理論上先證者母親為新發(fā)突變的攜帶者,先證者的AVPR2基因突變?yōu)樾掳l(fā)突變,來源于母親,表型和X 連鎖隱性遺傳性先天性尿崩癥相吻合。
1.4 治療及隨訪 給予患兒氫氯噻嗪2 mg/(kg·d),其尿量減少20%~30%,體溫降至正常,出院。患兒出院后目前調(diào)整為氫氯噻嗪聯(lián)合阿米洛利治療,門診隨訪1年,患兒存在生長發(fā)育落后,偶有低熱,尿量減少至30%~40%。
Fig.2 AVPR2 gene sequencing results圖2 AVPR2基因測序結(jié)果
國外報道AVPR2基因突變所致的CNDI,大約25萬例男性中有1例發(fā)病[3]。一項加拿大的研究顯示,在魁北克出生男嬰的X 連鎖CNDI 發(fā)病率約為8.8/100萬,約50%的AVPR2基因突變患者家系中可發(fā)現(xiàn)女性攜帶者,而其余患者為新發(fā)突變[4]。AVPR2基因位于染色體Xq28 區(qū),由3 個內(nèi)含子和2個外顯子組成,編碼1 個含有371 個氨基酸的蛋白,為G 蛋白偶聯(lián)受體。生理狀態(tài)下,AVP 與位于腎集合管基底膜主細胞上的AVPR2受體結(jié)合,激活腺苷酸環(huán)化酶(cyclic adenosine monophosphate,CAMP)產(chǎn)生級聯(lián)效應,從而激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),使細胞內(nèi)的AQP2磷酸化,易位到主細胞膜頂膜,發(fā)揮水的重吸收作用,實現(xiàn)尿液濃縮[5]。當AVPR2或AQP2基因位點突變造成遠端腎單位對AVP 的抗利尿激素作用不敏感或無反應,導致尿液濃縮功能障礙,從而發(fā)生CNDI。
AVPR2基因突變導致X連鎖CNDI,臨床上男性患者常見,而雜合子女性患者由于X 染色體的失活偏倚出現(xiàn)不同的臨床表型,臨床表現(xiàn)多樣,多飲、多尿的程度可有明顯不同[1]。AVPR2基因突變導致的X 連鎖CNDI 的位點在逐漸增加,目前共發(fā)現(xiàn)280 多種AVPR2基因突變,以錯義突變?yōu)橹鳎?],中國目前已發(fā)現(xiàn)32個AVPR2突變位點,錯義突變占29個[2]。根據(jù)基因序列分析及亞細胞分類將AVPR2基因突變分為5 類:第1 類突變干擾了mRNA 正確的轉(zhuǎn)錄、加工與翻譯,產(chǎn)生了截短蛋白質(zhì),這些蛋白通常被迅速降解;第2 類突變最為常見,AVPAR2基因的錯義突變或插入、缺失產(chǎn)生了全長蛋白,使蛋白錯誤折疊,雖然保持了內(nèi)在的功能,但由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)控機制與蛋白酶體降解的靶向性,使錯誤折疊蛋白被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),不能在細胞膜表面正常表達;第3類突變導致了血漿中膜表達受體與Gs 蛋白結(jié)合能力的下降,從而導致磷酸化途徑激活減弱,影響與Gs 蛋白的耦聯(lián);第4類突變導致對抗利尿激素親和力降低,突變雖然沒有影響AVPR2在細胞膜上的正常表達,但是與AVP 結(jié)合能力下降;第5 類突變被誤傳到不同亞細胞器中,突變基因可能編碼合成正常的受體蛋白,但在細胞內(nèi)錯誤定位,不能在細胞膜上正常表達[6-7]。此外,AVPR2突變也會發(fā)生“功能增益”,這些突變受體過度增加了對AVP 的親和力,導致腎源性的抗利尿激素不適當分泌[8]。
CNDI 多于嬰幼兒期發(fā)病,若飲水充分,患兒一般狀況可正常,無明顯體征,或僅有發(fā)熱、易激惹、便秘、嘔吐、生長障礙等非特異表現(xiàn),臨床醫(yī)師認識不足易誤診、漏診,耽誤最佳的治療時機,嚴重可致智力障礙、生長發(fā)育遲緩、腎積水、腎功能不全、嚴重的電解質(zhì)紊亂導致死亡。禁水試驗可初步判定患者是否為尿崩癥,禁水-加壓素試驗可以進一步區(qū)分神經(jīng)性尿崩癥和腎性尿崩癥,即給予外源性AVP 或去氨加壓素后,尿滲透壓變化不明顯或升高不超過50%,診斷為腎性尿崩癥[9]。CNDI 在腎性尿崩癥中僅占約10%,應慎重排除繼發(fā)性腎性尿崩癥。然而,有報道稱少數(shù)CNDI 患者在禁水試驗或外源性注射AVP后,尿液濃縮能力明顯增加[10],臨床稱為不完全型CNDI。這種殘存的尿濃縮能力可能是為了防止嚴重高滲脫水的發(fā)生。迄今,所有已證實為AVPR2基因錯義突變患者中,有17 例不完全型X-CNDI表型[10-11]。
兒童行禁水-加壓素試驗應密切監(jiān)測生命體征,以防出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)紊亂、休克、驚厥等并發(fā)癥。通常禁水6 h已足夠,體質(zhì)量下降超過5%則需終止試驗。禁水后尿滲透壓達不到血滲透壓的2.5 倍以上,而血滲透壓增高>305 mOsm/kg 可終止試驗,診斷為尿崩癥,其中尿滲透壓<血滲透壓者為完全性尿崩癥,尿滲透壓>血滲透壓者為部分性尿崩癥。小嬰兒若血尿滲透壓留取困難或醫(yī)療條件有限,可用尿比重計,禁水后每小時測尿比重,同時留尿常規(guī),若尿比重進行性增高,繼續(xù)留尿,若兩次尿比重之差<0.001,停止禁水試驗,行加壓素試驗,皮下注射垂體后葉素(0.1~0.2 IU/kg或5 IU/m2),重復上述操作,持續(xù)留尿至兩次尿比重之差<0.001支持腎性尿崩癥,或尿比重達1.015 以上提示垂體性尿崩癥。正常的垂體后葉呈現(xiàn)高信號是由于垂體后葉內(nèi)有含抗利尿激素的神經(jīng)分泌顆粒,一般認為垂體后葉T1W1 信號強弱與后葉血管加壓素含量密切相關(guān),本例患兒基因結(jié)果未回報前,垂體核磁短期內(nèi)出現(xiàn)T1W1 信號由正常變?yōu)橄?,臨床考慮是否為中樞性尿崩癥,而禁水-加壓素試驗支持腎性尿崩癥,給臨床診療造成了很大困擾,也曾試用AVP 治療,患兒癥狀無改善,換用氫氯噻嗪及阿米洛利治療,患兒癥狀明顯改善,基因結(jié)果也支持腎性尿崩癥的診斷。該患兒的垂體T1信號消失分析原因可能是與患兒病史較長,持續(xù)脫水未能完全糾正有關(guān),導致垂體后葉AVP 含量減少有關(guān),垂體后葉AVP 含量降低,垂體核磁T1加權(quán)像也會呈現(xiàn)高信號缺乏。
由于該癥較少見且存在異質(zhì)性,當出現(xiàn)不完全型CNDI 或因失活偏倚導致臨床癥狀輕微甚至無癥狀的X連鎖CNDI的雜合子女性患者,通過傳統(tǒng)的方法進行鑒別診斷較為困難。這時基因診斷顯得尤為重要,通過檢測AVPR2和AQP2不僅可以早期明確診斷,使患者得到及時治療,防止出現(xiàn)智力障礙、發(fā)育落后等嚴重并發(fā)癥,并為家族性病例提供遺傳學幫助,以及為突變基因攜帶的成年女性提供產(chǎn)前篩查。
CNDI 治療現(xiàn)狀主要是對癥治療而非針對病因治療。對癥治療的目的是補液同時聯(lián)合低鹽低蛋白飲食,防止脫水。藥物治療常用利尿劑和非甾體抗炎藥。氫氯噻嗪通過抑制遠曲小管對Na的重吸收,使尿量減少。近期研究發(fā)現(xiàn),氫氯噻嗪可減少鋰誘導腎性尿崩癥小鼠近端小管對Na的重吸收,減少尿量,同時氫氯噻嗪可以促進AQP2 在小鼠集合管上皮細胞的表達[12]。但長期單一用藥效果不佳,目前不作為首選[13]。氫氯噻嗪[2~4 mg/(kg·24 h)]聯(lián)合阿米洛利[0.3 mg/(kg·24 h)],能使患者尿量降低50%,耐受性較好,減少低鉀血癥的發(fā)生,是目前推薦的臨床一線用藥[14]。
隨著CNDI 分子生物學的發(fā)展以及發(fā)病機制的闡明,目前產(chǎn)生了很多針對病因的新型治療手段,根據(jù)CNDI 的類型不同,治療的靶點和策略也有所不同,針對CNDI的病因治療研究目前主要集中于3方面:(1)修復錯誤折疊蛋白,使其恢復正常的蛋白結(jié)構(gòu)并從滯留的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中脫離,進而正確定位到細胞膜表面[6]。(2)直接作用于滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的受體蛋白發(fā)揮作用[6]。(3)不通過AVPR2介導,直接激活AQP2[3]。但應用于臨床的安全性和有效性尚需進一步評估。