高效液相色譜測(cè)定抗壞血酸對(duì)映體色譜柱選擇

杜瑞 關(guān)炳峰 尹紅娜 王珂 孫茜茜 陳世偉

摘要[目的]選擇L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸在高效液相色譜分離中最佳色譜柱。[方法]對(duì)比C18柱、HILIC酰胺柱、HILIC聚合物柱、HILIC硅膠柱、氨基柱和氰基柱6種色譜柱填料分析抗壞血酸對(duì)映體的分離度和流動(dòng)相。[結(jié)果]HILIC酰胺柱分離度最大，為4.84;其次為氨基柱，分離度為2.80;流動(dòng)相為0.1%磷酸水和乙腈。[結(jié)論]HILIC酰胺柱為分析抗壞血酸對(duì)映體的最合適色譜柱填料。

關(guān)鍵詞高效液相色譜;L-抗壞血酸;D-異抗壞血酸;色譜柱

中圖分類(lèi)號(hào)O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2020）04-0196-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.057

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Ascorbic Acid Enantiomer Column by High Performance Liquid Chromatography

DU Rui，GUAN Bing-feng，YIN Hong-na et al（Henan Commerce Science Institute Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract[Objective]L-ascorbic acid and D-ascorbic acid were selected as the best chromatographic columns for HPLC separation.[Method]The C18 column，HILIC amide column，HILIC polymer column，HILIC silica column，amino column and cyano column were compared to analyze the ascorbic acid enantiomer resolution and mobile phase.[Result]The highest resolution of the HILIC amide column was 4.84;the second was the amino column with a resolution of 2.80;the mobile phase was 0.1% phosphoric acid water and acetonitrile.[Conclusion]HILIC amide column is the most suitable column packing for the analysis of ascorbic acid enantiomers.

Key wordsHPLC;L-ascorbic acid;D-isoascorbic acid;Chromatographic column

L-抗壞血酸（L-ascorbic acid）又稱(chēng)維生素C（Vitamin C），學(xué)名L-3-氧代蘇己糖醛酸內(nèi)酯[1]。L-抗壞血酸在人體內(nèi)不能合成，主要存在于蔬菜和水果中，天然具有抗氧化性質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和食品添加劑，廣泛用于食品加工和保健品行業(yè)中[2-3]。D-異抗壞血酸（D-isoascorbic acid）是L-抗壞血酸的對(duì)映異構(gòu)體，與L-抗壞血酸化學(xué)性質(zhì)相似，但生理活性僅有L-抗壞血酸的1/20[4]。D-異抗壞血酸作為食品抗氧化劑和肉制品的防腐助色劑[2，5-6]，但攝入過(guò)多會(huì)造成白細(xì)胞的抗病能力下降，使人體受到傷害[7]。

由于L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸生理活性不同，因此對(duì)抗壞血酸對(duì)映異構(gòu)體分析十分重要。在手性分析中，常用的分離手段有毛細(xì)管電泳法[8-10]和高效液相色譜法[11-15]。毛細(xì)管電泳分離方法雖然有很高的手性分析能力，但與HPLC相比柱容量小，造成不宜大體積高濃度進(jìn)樣;并且在食品安全檢測(cè)方面，毛細(xì)管電泳沒(méi)有高效液相色譜普及率高。筆者采用HPLC法測(cè)定抗壞血酸對(duì)映體，考察不同色譜填料（C18、HILIC、NH2、CN）對(duì)抗壞血酸對(duì)映體分離的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（阿爾塔科技有限公司）;D-異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（阿爾塔科技有限公司）;偏磷酸、磷酸三鈉、磷酸二氫鉀、磷酸（分析純，阿拉丁試劑）;十六烷基三甲基溴化銨（色譜純，阿拉丁試劑）;甲醇（色譜純，迪馬科技）;乙腈（色譜純，迪馬科技）。偏磷酸溶液（20 g/L）：稱(chēng)取20 g偏磷酸，溶于水定容至1 000 mL;0.1%磷酸水溶液：吸取磷酸1mL，加一級(jí)水定容至1 000 mL。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1290 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）。Agilent 1260 高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）。色譜柱：Poroshell 120 HILIC，3.0 mm×150mm×2.7 μm（美國(guó)安捷倫公司）;Accucore150 酰胺 HILIC，4.6 mm×150 mm×2.6 μm（美國(guó)Thermo Scientific公司）;Polyamino-HILIC，4.6 mm×250mm×5 μm（迪馬科技）;ZORBAX Eclipse XDB-CN，4.6 mm×150 mm×5 μm（美國(guó)安捷倫公司）;Ultimate XB-NH2，4.6 mm×250 mm×5 μm（月旭科技）;Diamonsil Plus C18，4.6 mm×250mm×5 μm（迪馬科技） 。

1.3方法

1.3.1色譜條件。

色譜柱 C18：流動(dòng)相A為6.8 g磷酸二氫鉀和0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，用水溶解并定容至1 L（用磷酸調(diào)pH 至2.5～2.8）;流動(dòng)相B為100%甲醇;A+B（98+2）。氨基柱、HILIC、氰基柱：流動(dòng)相A（0.1%磷酸）+B（乙腈）。檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。色譜柱 C18：準(zhǔn)確稱(chēng)取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸0.01 g（精確至0.01 mg），用20 g/L的偏磷酸溶液定容至10 mL。氨基柱、HILIC、氰基柱：準(zhǔn)確稱(chēng)取L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸0.01 g（精確至0.01 mg），用0.1%的磷酸水溶液定容至10 mL。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件比對(duì)

C18色譜柱是實(shí)驗(yàn)室常用色譜柱，采用C18分析抗壞血酸對(duì)映體過(guò)程中，由于抗壞血酸是多羥基化合物，極性大，在C18色譜柱上不保留;在分析檢測(cè)過(guò)程中，通常加入表面活性劑（十六烷基三甲基溴化銨）和緩沖鹽（磷酸二氫鉀）來(lái)改善色譜行為。HILIC親水作用色譜柱在液相色譜柱中常用來(lái)分析強(qiáng)極性和強(qiáng)親水化合物，常用流動(dòng)相是水和乙腈，并且乙腈相比例高于60%。

從表1可以看出，在抗壞血酸對(duì)映體分析過(guò)程中，采用反相模式的是C18色譜柱;采用HILIC 模式的是HILIC硅膠柱、HILIC酰胺柱和NH2柱;而HILIC聚合物柱不出峰。HILIC酰胺柱分離度最大，為4.84;而C18色譜柱分離度最小，為2.30。

從圖1可以看出，在不同分離模式下，L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸出峰順序發(fā)生變化;反相模式下，L-抗壞血酸先出峰，D-異抗壞血酸后出峰;而在HILIC模式條件下，出峰順序相反，D-異抗壞血酸先出峰。這主要是由于在反相模式下，流動(dòng)相采用98%水相;而HILIC模式條件下，流動(dòng)相采用75%以上的有機(jī)相。

在反相模式下，流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，在運(yùn)行過(guò)程中容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致基線不穩(wěn)，影響定性和定量;離子試劑會(huì)對(duì)色譜柱帶來(lái)不可逆轉(zhuǎn)的破壞，影響色譜柱壽命。流動(dòng)相中加入高濃度緩沖鹽，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，會(huì)造成液相流路中緩沖鹽析出，造成流路堵塞，影響儀器壽命。流動(dòng)相為高比例水相（98%），常規(guī)C18色譜柱長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)造成色譜柱填料“疏水塌陷”，致使色譜柱柱效降低，壽命縮短。因此需要選擇在C18色譜固定相鍵和過(guò)親水基團(tuán)的色譜柱，但會(huì)增加實(shí)驗(yàn)室成本。

在HILIC工作條件下，固定相表面會(huì)首先建立一個(gè)富集水的液體層，待分析物在流動(dòng)相和親水層之間進(jìn)行分配，從而實(shí)現(xiàn)分離，其中氫鍵作用和偶極矩作用是影響保留強(qiáng)弱的主要因素。HILIC固定相的作用主要是固定水，若固定相帶電荷，則離子靜電作用也會(huì)影響化合物在色譜柱保留。對(duì)照3種不同類(lèi)型HILIC（硅膠基質(zhì)、酰胺基質(zhì)、聚合物基質(zhì)）色譜柱，L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸的色譜行為差別很大。在HILIC酰胺色譜柱上，抗壞血酸對(duì)映體基線分離，且峰型窄而尖;在HILIC硅膠色譜柱上，抗壞血酸對(duì)映體基線分離，但響應(yīng)值很低，且峰型很寬。HILIC聚合物基質(zhì)色譜柱上，抗壞血酸對(duì)映體60 min內(nèi)不出峰，主要是由于該款色譜柱填料是由乙烯醇多孔聚合顆粒上鍵合氨基官能團(tuán)，耐堿性強(qiáng)，而試驗(yàn)條件流動(dòng)性為酸性。氨基柱在乙腈-水體系中，在高乙腈條件下可以作為HILIC親水作用色譜固定相。

2.2HILIC模式下流動(dòng)相比例對(duì)拆分的影響

HILIC酰胺色譜柱在乙腈條件下獲得很好的分離效果。以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，如圖2所示，通過(guò)增加流動(dòng)相中乙腈的比例（85%～95%），抗壞血酸對(duì)映體分離度增加，但響應(yīng)值降低。結(jié)合抗壞血酸對(duì)映體分離度和響應(yīng)值，HILIC酰胺色譜柱最佳流動(dòng)相條件為乙腈+0.1%磷酸水（90+10）。

氨基柱在乙腈-水體系下，高乙腈條件下，表現(xiàn)為HILIC模式。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈比例在75%～80%，分離度和響應(yīng)值均滿足色譜分離要求（圖3）。

3結(jié)論

從抗壞血酸對(duì)映體分離度方面來(lái)講，HILIC酰胺柱、氨基柱和C18色譜柱都能實(shí)現(xiàn)基線分離，且分離度均大于2。其中HILIC酰胺柱分離度最高，其次為氨基柱。從流動(dòng)相方面角度，HILIC酰胺柱和氨基柱，流動(dòng)相為0.1%磷酸水和乙腈，無(wú)需添加離子對(duì)試劑和高濃度的緩沖鹽，流動(dòng)相成本更低，前處理簡(jiǎn)單，對(duì)儀器的損傷更小。因此，在實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定抗壞血酸對(duì)映體時(shí)，可以優(yōu)先選擇HILIC酰胺柱，其次為氨基柱。

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