濃香型白酒中己酸檢測(cè)方法研究

季 方，張士陽(yáng)，吳建峰，左文霞，孫 瑩，唐群勇，桂 翔

（江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 漣水 223411）

2015年8月25日，全國(guó)白酒標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)濃香型白酒分技術(shù)委員會(huì)在成都完成了對(duì)《濃香型白酒》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)送審稿的審定工作。在此次標(biāo)準(zhǔn)修訂工作中，最引人注目的一項(xiàng)變動(dòng)就是將己酸和己酸乙酯的含量進(jìn)行合并計(jì)算代替原標(biāo)準(zhǔn)中的己酸乙酯含量。在濃香型白酒中，酸類和酯類物質(zhì)是白酒風(fēng)味物質(zhì)的重要骨架部分，其中己酸乙酯更是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)[1]，也是衡量、驗(yàn)證濃香型白酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵理化指標(biāo)。隨著我國(guó)白酒消費(fèi)逐步走向多樣化，酒類正朝著中低度、營(yíng)養(yǎng)、優(yōu)質(zhì)方向發(fā)展，在中低度白酒生命周期中，己酸乙酯水解現(xiàn)象成為了一個(gè)普遍存在的技術(shù)問(wèn)題[2]。己酸乙酯水解與己酸酯化反應(yīng)同時(shí)存在于酒體之中，二者相互轉(zhuǎn)化方向受各種因素的影響不斷移動(dòng)直至達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。在中低度酒中，由于乙醇含量較低的緣故使己酸乙酯水解反應(yīng)更容易發(fā)生。隨著貨架期儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)和儲(chǔ)存條件的變化，老酒體中己酸乙酯含量較新酒體會(huì)不可避免地下降，己酸含量則會(huì)上升[3]。如按照舊標(biāo)中的規(guī)定，老酒中己酸乙酯含量就有可能低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以下，從而被判定不合格。針對(duì)這一問(wèn)題，新標(biāo)準(zhǔn)以“己酸＋己酸乙酯”代替了“己酸乙酯”，用濃度之和的理化指標(biāo)要求規(guī)避了二者濃度尤其是己酸乙酯濃度不穩(wěn)定的現(xiàn)象，從而在一定程度上保障了老酒的“合法權(quán)益”。

除了己酸，白酒中還含有其他多種有機(jī)酸，這些酸類物質(zhì)不僅能賦予白酒豐滿和酸刺激感，而且還是很多酯類物質(zhì)的重要前體物質(zhì)。目前行業(yè)中關(guān)于白酒的風(fēng)味物質(zhì)成分有大量的研究[4-9]，眾多的前處理方法和儀器分析技術(shù)被用來(lái)分析白酒中的風(fēng)味成分[10-18]。隨著《濃香型白酒》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂工作逐步推進(jìn)，建立一種準(zhǔn)確、高效分析白酒中己酸含量的方法便成為了一項(xiàng)重要任務(wù)。

氣相色譜（gas chromatography，GC）是現(xiàn)階段白酒微量分析中最常用的技術(shù)。作為一種封閉系統(tǒng)色譜，其受外界影響較小，分離性能高、分析速度快、靈敏度也很高。氣相色譜直接進(jìn)樣法是一種酒樣不經(jīng)處理或簡(jiǎn)單處理后就直接進(jìn)入氣相色譜分析方法，避免了樣品處理過(guò)程中物質(zhì)損失，具有良好的重現(xiàn)性和檢測(cè)準(zhǔn)確性?；跉庀嗌V的氫火焰檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）分析方法是目前最常見(jiàn)的白酒中微量成分定量方法，能夠?qū)Π核嵩趦?nèi)的眾多成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析。并且氣相色譜直接進(jìn)樣法可以同時(shí)測(cè)定己酸、己酸乙酯等，尤其適合企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)作為白酒質(zhì)量常規(guī)檢測(cè)方法。但是相對(duì)于醇類、酯類組分，己酸的極性較強(qiáng)，沸點(diǎn)較高，因此對(duì)色譜系統(tǒng)，如色譜柱、襯管等有比較高的要求，需要采用特殊改良的聚乙二醇色譜柱來(lái)防止普己酸峰拖尾。高負(fù)荷的色譜柱同樣會(huì)使己酸峰逐漸拖尾，影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。劉莎等[19]建立了氣相色譜-FID檢測(cè)器分析白酒中22種風(fēng)味物質(zhì)的分析方法。在選定的色譜條件下，采用Agilent 19091N-213安捷倫色譜柱，己酸工作曲線相關(guān)系數(shù)≥0.999，平均加標(biāo)回收率為108.1%，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.9%。檢出限達(dá)到了0.5 mg/mL。吳麗華等[20]利用LZP-930型白酒毛細(xì)管色譜柱，采用氣相色譜法對(duì)白酒中29種微量成分進(jìn)行色譜分離條件優(yōu)化，建立了白酒中微量成分毛細(xì)管氣相色譜分析方法。在選定的色譜條件下，己酸加標(biāo)回收率達(dá)到了99.0%。胡國(guó)英等[21]建立一種毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定白酒中有機(jī)酸類組分含量的方法。選擇DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）毛細(xì)管氣相色譜柱，通過(guò)優(yōu)化氣相色譜分離條件，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。結(jié)果表明各有機(jī)酸類物質(zhì)相關(guān)系數(shù)均＞0.999，己酸為0.999 59，回收率88.0%～98.0%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.83%。

現(xiàn)行白酒中的己酸檢測(cè)受色譜柱或儀器性能等方面的影響，如完全按照《濃香型白酒》報(bào)批稿中的條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果誤差較大。本研究將結(jié)合實(shí)際工作和實(shí)驗(yàn)條件，將對(duì)己酸檢驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。采用毛細(xì)管氣相色譜分析聯(lián)合內(nèi)標(biāo)法，通過(guò)對(duì)升溫方式和速率、進(jìn)樣口溫度、載氣流量、分流比、進(jìn)樣量等色譜條件的優(yōu)化，以期建立適用于準(zhǔn)確、快速測(cè)定濃香型白酒中己酸含量的檢測(cè)方法。通過(guò)開(kāi)展精密度試驗(yàn)及不同加標(biāo)水平下的己酸加標(biāo)回收試驗(yàn)，對(duì)該檢測(cè)方法的可行性進(jìn)行確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-乙基丁酸（純度≥99.9%）、己酸（純度≥99.5%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

試驗(yàn)酒樣（1號(hào)酒樣38%vol、2號(hào)酒樣40%vol、3號(hào)酒樣42%vol、4號(hào)酒樣52%vol）：江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司的成品酒。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜儀（配備毛細(xì)管柱分流/不分流進(jìn)樣系統(tǒng)及10 μL自動(dòng)進(jìn)樣器）、氫火焰離子化檢測(cè)器、CPWax 57CB（50 m×0.25 mm，0.20 μm）色譜柱：美國(guó)Agilent公司；BSA124S電子天平：德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)50%）：量取50 mL無(wú)水乙醇，用水定容至100 mL，混勻。

己酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（43.500 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取4.350 g（精確至0.001 g）己酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，混勻，0～4 ℃低溫冰箱密封保存。2-乙基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（體積分?jǐn)?shù)2%）：吸取2 mL2-乙基丁酸至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至100 mL，混勻，0～4 ℃低溫冰箱密封保存。己酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取14.368 μL、28.736 μL、57.472 μL、114.944 μL、172.414 μL、229.888 μL己酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于6個(gè)10 mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，依次配制成己酸含量為0.062 5 mg/mL、0.125 0 mg/mL、0.250 0 mg/mL、0.500 0 mg/mL、0.750 0 mg/mL、1.000 0 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

初始條件依據(jù)《濃香型白酒》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）附錄B.1氣相色譜法（第一法，仲裁法）設(shè)定：

柱溫：初始溫度35 ℃保持1 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，以15 ℃/min升至210 ℃，保持6 min；檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：20∶1。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別采取改變升溫方式和速率、進(jìn)樣口溫度、載氣流量、分流比、進(jìn)樣量單一條件的方式來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)己酸分離條件的影響。根據(jù)綜合判斷評(píng)比得出相對(duì)報(bào)批稿更為優(yōu)化的檢測(cè)條件：

柱溫：初始溫度45 ℃保持8 min，以4 ℃/min升至130 ℃，以20 ℃/min升至200 ℃，保持15 min；檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；載氣流量：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：0.5 μL；分流比：40∶1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取10 mL己酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于6個(gè)試管里，然后加入0.1 mL2-乙基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，測(cè)定己酸和內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸色譜峰面積，以己酸系列工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以己酸和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 定性定量檢測(cè)

調(diào)整Agilent 7890B氣相色譜儀器至最佳工作狀態(tài)，待儀器穩(wěn)定后，吸取10 mL試樣于試管中，加入0.1 mL 2-乙基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)已知的己酸標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖上的保留時(shí)間對(duì)白酒中的己酸進(jìn)行定性分析，同時(shí)記錄己酸和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣中己酸的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化及定性檢測(cè)

完全按照?qǐng)?bào)批稿附錄B中的色譜條件對(duì)己酸標(biāo)樣和2-乙基丁酸標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖1可知，己酸色譜峰的峰型較差，且色譜圖出現(xiàn)明顯的基線漂移，影響積分面積，進(jìn)而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。由圖2可知，己酸色譜峰的峰型較好，同時(shí)基線漂移情況有明顯改善。

將加過(guò)2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)的酒樣注入氣相色譜儀中，經(jīng)檢測(cè)，酒樣中的己酸和2-乙基丁酸的保留時(shí)間分別為35.413 min和34.288 min，標(biāo)樣中己酸和2-乙基丁酸的保留時(shí)間分別為35.415 min和34.292 min，相對(duì)偏差分別為0.003%和0.006%，色譜峰保留時(shí)間匹配度較好。

圖1 色譜條件優(yōu)化前己酸和內(nèi)標(biāo)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of hexanoic acid and internal standard before chromatographic conditions optimization

圖2 色譜條件優(yōu)化后己酸的色譜圖Fig.2 Chromatogram of hexanoic acid internal standard after chromatographic conditions optimization

表1 己酸和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間差異Table 1 Difference of retention time between hexanoic acid and internal standard

2.2 校準(zhǔn)曲線

圖3 己酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of hexanoic acid

以配制的己酸標(biāo)樣與2-乙基丁酸濃度之比為橫坐標(biāo)，以己酸標(biāo)樣和2-乙基丁酸色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制己酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。根據(jù)GB/T 27404—2008附錄F技術(shù)要求，對(duì)于確認(rèn)方法，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)≥0.99，該實(shí)驗(yàn)做出的校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 74，達(dá)到了國(guó)標(biāo)GB/T 27404—2008的技術(shù)要求。

2.3 精密度試驗(yàn)

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)4個(gè)白酒樣品分別進(jìn)行6次平行檢測(cè)，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，4個(gè)白酒樣品中的己酸測(cè)定結(jié)果RSD分別為1.317%、2.020%、1.999%、3.532%，表明采用優(yōu)化后的色譜條件測(cè)定結(jié)果精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of precision tests (n=6)

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別向裝有10 mL酒樣的試管中加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL己酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度為43.500 mg/mL），按照優(yōu)化的氣相色譜條件，平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率。加標(biāo)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL三個(gè)加標(biāo)水平下，1號(hào)酒樣的平均回收率分別為96.1%、98.2%、102.9%，2號(hào)酒樣的平均回收率分別為101.1%、98.9%、101.9%，3號(hào)酒樣的平均回收率分別為99.4%、99.6%、101.3%，4號(hào)酒樣的平均回收率分別為102.8%、99.2%、101.0%，表明采用優(yōu)化后的條件測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度良好。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of adding standard recovery rate tests (n=6)

3 結(jié)論

該方法運(yùn)用毛細(xì)管柱氣相色譜儀，依據(jù)《濃香型白酒》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）附錄B《白酒中己酸含量的測(cè)定方法》中氣相色譜法（第一法仲裁法），通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，建立了濃香型白酒中的己酸的檢測(cè)方法。采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和保留時(shí)間進(jìn)行物質(zhì)的定性，以內(nèi)標(biāo)法和多點(diǎn)校正進(jìn)行白酒中己酸含量的檢測(cè)。參照GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F要求，在該方法檢測(cè)條件下，己酸的精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.132%～0.353%之間，回收率在96.1%～102.9%之間（n=6），符合GB/T 27404—2008檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求，說(shuō)明建立的測(cè)定白酒中己酸的方法符合《濃香型白酒》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，可以用于濃香型白酒中的己酸含量的檢測(cè)。