一種異丙威膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條的研制

馮月君，張 瑜，萬(wàn)宇平，賈芳芳，李 靜，王喜平，王兆芹，何方洋

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京望爾生物技術(shù)有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206）

異丙威又名滅撲散、葉嬋散，屬于氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。1970年，異丙威被推薦用作殺蟲(chóng)劑，觸殺作用較強(qiáng)，在防治水稻害蟲(chóng)中發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)，由于異丙威在農(nóng)作物中的使用量不斷增加，導(dǎo)致了農(nóng)藥殘留量較高，人體食用了農(nóng)藥殘留較多的農(nóng)作物，危害健康。

異丙威屬于速效性農(nóng)藥，應(yīng)用較為廣泛，然而快速檢測(cè)方法或文獻(xiàn)很少。目前，檢測(cè)異丙威藥物殘留的方法多為儀器方法[1]，主要有氣相色譜質(zhì)譜法[2-5]、高效液相色譜法[6-11]、分散型固相萃取-氣相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等，操作較復(fù)雜，成本較高，儀器方法較難應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè)，目前尚未查閱到膠體金免疫層析法檢測(cè)異丙威的相關(guān)文獻(xiàn)，因此，本實(shí)驗(yàn)采用快速檢測(cè)方法中的膠體金免疫層析法，研制一種異丙威膠體金免疫層析試紙條，以期建立能夠檢測(cè)蔬菜、水果中的異丙威農(nóng)藥殘留的異丙威膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異丙威標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）、甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）、亞胺菌標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）、乙霉威標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）、異丁草胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；氯金酸（HAuCl4·3H2O）（分析純）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（分析純）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（分析純）：美國(guó)Sigma公司；檸檬酸三鈉（分析純）、碳酸鉀（分析純）、4-氨基-2-異丙基苯酚（分析純）、三乙胺（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、二氯甲烷（分析純）、正己烷（分析純）、吡啶（分析純）、石油醚（分析純）、三氟乙酸（分析純）、三氯甲烷（分析純）、硫酸鈉（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：北京中生百欣科技服務(wù)有限責(zé)任公司；蔬菜、水果：城北農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；樣本提取劑（0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液）、樣本復(fù)溶液（0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液）：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；8周齡小鼠：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GT-700膠體金分析儀：北京勤邦生物技術(shù)有限公司；MX-F渦旋儀、HFJ-10均質(zhì)器：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異丙威半抗原的制備

取4-氨基-2-異丙基苯酚1.51 g，加二氯甲烷50 mL溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18 g，三乙胺0.4 mL，室溫?cái)嚢? h，停止反應(yīng)，旋蒸，除去有機(jī)溶劑，加水30 mL，乙酸乙酯40 mL×3萃取3次，合并有機(jī)相，蒸干，二氯甲烷∶正己烷（1∶7，V∶V）90 mL重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ2.3 g，收率92%。

取化合物Ⅰ2.3 g，加無(wú)水丙酮60 mL溶解，0～5 ℃條件下，滴加異氰酸甲酯0.73 g，加吡啶1.2 mL，充分?jǐn)嚢韬?，恢?fù)至室溫，繼續(xù)攪拌3 h；旋蒸，除去有機(jī)溶劑，上硅膠柱，石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，V∶V）洗脫分離，得到化合物Ⅱ2.7 g，收率96.43%。

取化合物Ⅱ2.7 g，加三氟乙酸40 mL溶解，室溫?cái)嚢? h后停止反應(yīng)，旋蒸，除去溶劑，加三氯甲烷100 mL，溶解澄清，水洗三次，取有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥后，蒸干，加乙酸乙酯：正己烷（1∶10，V∶V）120 mL進(jìn)行重結(jié)晶，得到氨基異丙威半抗原產(chǎn)物1.4 g，收率77%。

異丙威半抗原的合成見(jiàn)圖1。

圖1 異丙威半抗原的合成Fig.1 Synthesis of isoprocarb hapten

1.3.2 免疫原的制備

取氨基異丙威半抗原50 mg，加1 moL/L鹽酸0.48 mL，加水5 mL，攪拌溶解，靜置5 min，0～5 ℃攪拌30 min，加亞硝酸鈉17.2 mg，繼續(xù)攪拌3 h，得到活化液A液；取BSA 500 mg，加0.1 moL/L氫氧化鈉溶液30 mL溶解，0～5 ℃攪拌30 min，得到B液，將全部的A液滴加到B液中，攪拌4 h。0.02 moL/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）透析3 d，每天換液3次，得到異丙威-BSA免疫原，-20 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

1.3.3 包被原的制備

取氨基異丙威半抗原30 mg，加1 moL/L鹽酸0.27 mL，加水5 mL，攪拌溶解，澄清，0～5 ℃攪拌30 min，加亞硝酸鈉13.1 mg，繼續(xù)攪拌3 h，得到活化液A液；取OVA 500 mg，加0.1 moL/L氫氧化鈉溶液30 mL溶解，0～5 ℃攪拌30 min，得到B液，將全部的A液滴加到B液中，攪拌4 h。在0.02 moL/L PBS緩沖液中透析3 d，3 h換一次緩沖液，每天換液3次，得到異丙威-OVA包被原，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 單克隆抗體的制備

將免疫抗原與弗氏完全佐劑體積比1∶1充分乳化，免疫8周齡BaLb/c小鼠，取免疫后的鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用體內(nèi)誘生法[20]得到異丙威單克隆抗體溶液，-20 ℃保存。

1.3.5 膠體金的制備

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰；一邊攪拌，一邊準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。

1.3.6 異丙威單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2 moL/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入80 μg異丙威單克隆抗體，混勻，靜置10 min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積分?jǐn)?shù)為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 微孔試劑的制備

將100 μL異丙威單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔試劑微孔板中，置于冷凍干燥機(jī)，冷阱溫度為-50 ℃，預(yù)凍3 h，再真空干燥15 h，即得到異丙威單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑。

1.3.8 樣本中異丙威的檢測(cè)

前處理方法：擦掉白菜/蘋(píng)果樣品表面泥土，剪成1 cm左右見(jiàn)方的碎片；稱(chēng)取樣品1 g至燒杯或提取瓶中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩2 min；倒出樣品溶液，靜置3 min，將上清液倒入玻璃管中并進(jìn)行編號(hào)，待檢。

向微孔中加入100 mL待檢樣本溶液，混勻，室溫下孵育3 min，吸取70 μL滴至試紙條上，反應(yīng)10 min，根據(jù)圖2判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果。其他時(shí)間判讀無(wú)效。

圖2 試紙條結(jié)果判定示意圖Fig.2 Schematic diagram of strip result determination

1.3.9 方法學(xué)考察

（1）試紙條的最低檢出限

在空白蔬菜、水果樣本中分別添加異丙威標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.8所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定試紙條的最低檢出限（limit of detection，LOD）。

（2）試紙條的特異性

《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：采用與待檢藥物同類(lèi)藥物、類(lèi)似物或可能聯(lián)合使用的藥物測(cè)定特異性，因此，本研究分別配制500 μg/L的甲草胺、亞胺菌、乙霉威和異丁草胺等藥物，用此試紙條檢測(cè)，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

（3）試紙條的準(zhǔn)確性

總局辦公廳關(guān)于印發(fā)食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的通知（食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號(hào)）：以假陽(yáng)性率和假陰性率評(píng)價(jià)膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取50份用儀器測(cè)定的空白蔬菜、水果樣品，用該試紙條檢測(cè)異丙威藥物殘留，計(jì)算假陽(yáng)性率；取50份用儀器測(cè)定的添加異丙威質(zhì)量濃度至10 μg/kg的陽(yáng)性蔬菜、水果樣品，再用該試紙條檢測(cè)異丙威藥物殘留，計(jì)算假陰性率?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)＜5%，假陰性率應(yīng)為零。

（4）試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8 ℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測(cè)定15個(gè)月。具體方法為：分別檢測(cè)20份空白蔬菜、水果樣品，添加異丙威質(zhì)量濃度至10 μg/kg，重復(fù)測(cè)定2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無(wú)雜質(zhì)、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，膠體金顆粒的均一程度，測(cè)量金顆粒粒徑，經(jīng)透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑為20 nm左右。

圖3 膠體金電鏡掃描結(jié)果（×100 000）Fig.3 Microscope scanning results of colloidal gold (×100 000)

2.2 試紙條的最低檢出限

制備異丙威質(zhì)量濃度分別為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L的蔬菜、水果樣品，按照1.3.8步驟進(jìn)行檢測(cè)，確定試紙條的最低檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，0～8 μg/L檢測(cè)結(jié)果為陰性，10～14 μg/L的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，因此，該試紙條的最低檢出限為10 μg/kg。

表1 試紙條的檢出限Table 1 Detection limit of test strip

2.3 試紙條的特異性

按照1.3.9（2）步驟進(jìn)行檢測(cè)，使用該試紙條檢測(cè)質(zhì)量濃度為500 μg/L的甲草胺、亞胺菌、乙霉威和異丁草胺等藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條對(duì)以上藥物無(wú)交叉，特異性較好。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of specificity tests

2.4 試紙條的準(zhǔn)確性

按照1.3.9節(jié)步驟進(jìn)行檢測(cè)，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 假陽(yáng)性（A）及假陰性（B）試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of false positive (A) and false negative (B) tests

由圖5A可知，用試紙條檢測(cè)50份空白蔬菜、水果樣品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明假陽(yáng)性率＜5%；由圖5B可知，添加異丙威質(zhì)量濃度為10 μg/kg的50份陽(yáng)性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

2.5 試紙條的穩(wěn)定性

按照1.3.9節(jié)步驟進(jìn)行檢測(cè)，其中白菜部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，12個(gè)月內(nèi)，試紙條的假陽(yáng)性率和假陰性率均符合要求，從第13個(gè)月起，試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象。因此，試紙條的穩(wěn)定性良好。

圖6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of stability tests

3 結(jié)論

本研究通過(guò)制備異丙威半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試，均符合要求。本試驗(yàn)研制的試紙條最低檢出限為10 μg/kg，而且試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15 min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中高效液相色譜法、氣相色譜等儀器方法靈敏度更高，用時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)便，儀器方法和薄層掃描法方法較為復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間至少為1 h以上，對(duì)于基層檢測(cè)單位來(lái)說(shuō)，花費(fèi)的時(shí)間成本和檢測(cè)成本均很高，因此本研究的快速檢測(cè)試紙條能夠有效解決這個(gè)問(wèn)題，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。