豬肺源致病性大腸桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染病原的分離鑒定及主要毒力因子的檢測

蔡瑤 周雪珂 江朝源 曾喻兵 徐志文 朱玲

關(guān)鍵詞：豬;腸外致病性大腸桿菌;化膿隱秘桿菌;分離鑒定;混合感染;毒力基因

中圖分類號：S852.61+2

文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0254-03

Key words：pig;extraintestinal pathogenic Escherichia coli;Trueperella pyogenes;isolation and identification;mixed infection;virulence gene

大腸桿菌是一種重要人畜共患病病原體，可感染人和多種動物，根據(jù)其對宿主寄生部位不同，劃分為腸內(nèi)致病性大腸桿菌和腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）[1]。近幾年來，國內(nèi)外眾多學者陸續(xù)報道了關(guān)于ExPEC的感染案例，指出其可特異性定殖于宿主腸道外，使感染宿主發(fā)生不同程度的腦膜炎、敗血癥、泌尿道及呼吸道感染[2]。目前在ExPEC中發(fā)現(xiàn)了多種毒力因子，包括與其致病性相關(guān)的毒力島（PAI）、黏附素、侵襲素、毒素、表面抗原、鐵攝取系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)等[3]。

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes，原名Arcanobacterium pyogenes）又名化膿放線菌或化膿棒狀桿菌，為隱秘桿菌屬（Trueperella）細菌。可以感染牛、羊、豬、林麝等重要經(jīng)濟動物，也可以感染人，是一種機會致病菌[4]?；撾[秘桿菌可在家畜間廣泛傳播，常引起感染動物化膿性肺炎及乳房炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性淋巴結(jié)炎，甚至會造成宿主流產(chǎn)和不孕等，最嚴重時可引發(fā)膿毒敗血癥導致家畜死亡[5]。目前已發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌毒力因子有 4 類，分別為化膿隱秘桿菌溶血素（PLO）、膠原結(jié)合蛋白質(zhì)（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白質(zhì)（Fim）[6]。

秋季早晚溫差大，豬群發(fā)生呼吸道疾病的可能性增加，發(fā)病的原因也是多種多樣，多數(shù)由細菌、病毒或寄生蟲等感染，甚至由多種病原混合感染誘發(fā)[7]。2018年10月，四川省蒲江地區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場部分豬只出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀，包括仔豬、保育豬、母豬均有發(fā)病，具體表現(xiàn)為呼吸急促且伴隨厚重的喘氣聲，耳部發(fā)紺，眼部、鼻腔部黏液增多，采食減少，體溫升高，最后因呼吸衰竭而亡。采用常用細菌分離方法結(jié)合16S rRNA基因序列分析綜合鑒定病原菌，分離出1株腸外致病性大腸桿菌和1株化膿隱秘桿菌。為詳細了解細菌毒力情況，對這2種菌進行特異性毒力基因檢測，同時選用常用抗生素對分離菌進行藥敏試驗，為臨床用藥提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1樣品來源

樣品來源于四川省蒲江某豬場發(fā)病瀕死保育豬，無菌采集病豬心臟、肺臟、肝臟及肺門淋巴結(jié)、脾臟備用。

1.2細菌16S rRNA基因的擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

細菌基因組DNA的提取按試劑盒說明書進行。細菌16S rRNA通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，F(xiàn)-16S rRNA為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，R-16S rRNA為5′- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，預期擴增長度為1 465 bp。反應體系（30 μl）：上、下游引物各0.5 μl（20 μmol/L），細菌基因組1.5 μl（634 ng/μl），2×Taq PCR MasterMix 15.0 μl，ddH2O 12.5 μl。反應條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。

PCR產(chǎn)物用回收試劑盒回收片段，與pMD-19T載體16 ℃過夜連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆后送至上海生物工程公司測序。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表菌株序列進行比對分析。

1.3分離株毒力因子的檢測及測序

根據(jù)文獻[8]～[10]所設(shè)計的9對腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）毒力基因papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT特異性引物，同時根據(jù)Zastempowska等[11]、徐凝等[12]設(shè)計的8對化膿隱秘桿菌的毒力基因plo、nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimE、fimG特異性引物檢測兩種細菌的毒力基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分別以大腸桿菌和化膿隱秘桿菌基因組為模板進行毒力因子的擴增，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4藥敏試驗

參照CLSI標準[13]，采用紙片擴散法測定兩株菌對臨床上常用抗生素的敏感情況，測量抑菌圈的直徑，判定藥敏試驗結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1分離株16S rRNA基因擴增結(jié)果及進化樹分析

提取分離菌株DNA，用16S rRNA基因通用引物擴增出1 465 bp的目的片段，測序后將結(jié)果與GenBank上已發(fā)表序列進行同源性分析。結(jié)果顯示疑似大腸桿菌菌株（MS-1）與大腸桿菌CP022959.1同源性達99%且位于一個分支上，疑似化膿隱秘桿菌菌株（MS-2）與化膿隱秘桿菌CP007519.1同源性達99%且位于一個分支上。確認分離到1株大腸桿菌和1株化膿隱秘桿菌，且由于大腸桿菌是從患病豬的肺部病變區(qū)域中分出，在病豬腸道并未發(fā)現(xiàn)明顯的病變，初步判定該大腸桿菌為腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）。

2.2分離菌株毒力因子擴增結(jié)果

以大腸桿菌基因組為模板，對9種毒力因子進行PCR檢測，結(jié)果擴增出iutA（314 bp）、fyuA（787 bp）基因，未擴增出papA、sfaS、focG、hlyD、afa、ireA、vaT基因;以化膿隱秘桿菌基因組為模板，對8種毒力因子進行PCR檢測，擴增出plo （150 bp）、nanH （1004 bp）、fimA （605bp）、fimC（843bp）、fimG（929bp）基因，未擴增出nanP、cbpA、fimE基因。

2.3藥敏試驗

分別對分離出的大腸桿菌和化膿隱秘桿菌進行常用抗生素的敏感性試驗，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗紙片法抑菌范圍解釋標準進行藥物敏感性判斷，結(jié)果顯示兩種菌對慶大霉素、頭孢噻肟以及氟苯尼考均表現(xiàn)敏感。

3討論

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀以及實驗室常用細菌分離和16S rRNA基因序列測定結(jié)果，結(jié)合之前實驗室檢測結(jié)果（未發(fā)現(xiàn)患病豬有寄生蟲感染跡象，且常見呼吸道病毒性疾病檢測結(jié)果全部為陰性），綜合判定該豬場疫情由大腸桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染造成。

有研究者認為，從動物腸道以外的臟器中分離到的大腸桿菌均可判定為ExPEC，也有人提出可根據(jù)大腸桿菌攜帶的特定毒力基因種類和數(shù)量初步確定是否為ExPEC[14]。在本研究中，我們從豬肺臟中分離出1株具有較強致病性的大腸桿菌，通過基因檢測發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌具有iutA、fyuA 2種毒力基因，綜合判定其為腸外致病性大腸桿菌。iutA是大腸桿菌代謝相關(guān)毒力基因，是鐵攝取蛋白系統(tǒng)中的一種基因，對細菌的生存至關(guān)重要。fyuA基因也參與鐵的攝取，是耶爾森強毒力島（HPI）中的核心結(jié)構(gòu)和功能基因，與大腸桿菌毒力的進化密切相關(guān)[3]。Jost等[4]研究結(jié)果表明，化膿隱秘桿菌的毒力是由多種毒力因子決定的，各類毒力基因具有協(xié)同作用，并且細菌可以在不同宿主中差異表達各種毒力基因而引發(fā)不同的感染癥狀。本研究中分離出的化膿隱秘桿菌中檢測出8種毒力基因中的5種（plo、nanH、fimA、fimC、fimG），其中plo編碼的溶血素（plo）是一種細菌外毒素，能夠裂解多種動物的紅細胞、免疫細胞，引起動物皮膚壞死最終死亡。神經(jīng)氨酸酶nanH也具有多種毒力作用：分解宿主唾液酸作為碳源提高自身在宿主的生存力;降低細胞膜表面的黏滯性，促進其對宿主細胞的感染力;分解免疫球蛋白IgA，降低宿主防御能力。針對化膿隱秘桿菌菌毛合成蛋白質(zhì)的研究還不夠深入，只知道其與細菌的黏附作用相關(guān)，目前已報道的4種化膿隱秘桿菌菌毛合成蛋白質(zhì)中，本研究分離的菌株中含3種，推測該菌可能具有較強的黏附性。

大腸桿菌是豬臨床中較為常見的一種傳染病原，以往也有腸外致病性大腸桿菌引發(fā)豬肺炎的病例報道[15]，而化膿隱秘桿菌感染的案例在林麝、牛、羊中報道的較多，對豬感染的案例相對較少。但近年來，國內(nèi)報道從豬呼吸道疾病中分離出化膿隱秘桿菌的頻率也逐年提高[16-19]。在林麝[20]、奶牛[21-22]中有報道大腸桿菌會同化膿隱秘桿菌混合感染，尤其是奶牛，在大多數(shù)患有乳房炎和子宮炎的奶牛中都能分離出大腸桿菌和化膿隱秘桿菌。但是，在豬呼吸道疾病中卻幾乎沒有大腸桿菌同化膿隱秘桿菌混合感染的病例報道，本研究發(fā)現(xiàn)這2種細菌在豬中的混合感染，對今后豬病的研究具有較好的參考價值。Jost等[4]在對機會致病菌化膿隱秘桿菌的研究中也發(fā)現(xiàn)，化膿隱秘桿菌不是具有實質(zhì)致病潛力的細菌，往往同其他病原體共同感染導致宿主發(fā)病。Zerbe等[21]和Bicalho等[22]在大腸桿菌和化膿隱秘桿菌的毒力因子與奶牛子宮疾病的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染后會抑制奶牛子宮中性粒細胞的功能，很有可能是大腸桿菌先感染奶牛子宮造成子宮內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，從而給化膿隱秘桿菌提供適宜的生存條件，繼發(fā)感染導致子宮內(nèi)膜炎的加重和生殖功能衰竭。Wagener等[23]研究發(fā)現(xiàn)并不是所有大腸桿菌都會促進化膿隱秘桿菌的感染，而只有腸外致病性大腸桿菌菌株（ExPEC）才能促進化膿隱秘桿菌感染。對小鼠的致病性研究結(jié)果表明，兩種菌混合感染會相互加強毒力。而藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，兩種菌對慶大霉素、頭孢噻肟以及氟苯尼考均表現(xiàn)敏感，這3種藥物對兩種病原菌均可能具有較強的殺滅作用。

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（責任編輯：張震林）