蚯蚓防控西瓜枯萎病的效果及其機理探索

張娟琴 李雙喜 鄭憲清 張翰林 白娜玲 張海韻 呂衛(wèi)光

摘要：為了探明蚯蚓對西瓜枯萎病的影響機制，開拓西瓜枯萎病防控的新思路，本試驗以西瓜連作土壤為基質(zhì)，采用盆栽試驗，研究不同密度的威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）和赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）對西瓜長勢、枯萎病發(fā)病率的影響，結(jié)合西瓜?；图怄哏牭毒鷶?shù)量、土壤微生物總量（土壤微生物量碳含量）、土壤微生物活性（土壤脫氫酶活性）以及土壤總酚酸的動態(tài)變化，探索蚯蚓對西瓜植株枯萎病的防控機理。結(jié)果表明，西瓜定植后45 d，試驗組的西瓜蔓長、鮮質(zhì)量較不投放蚯蚓對照分別增長了18.57%～67.27%、39.29%～87.24%。西瓜定植后30 d、45 d，對照的西瓜植株枯萎病發(fā)病率分別為62.15%、85.32%，顯著高于蚯蚓試驗組（P<0.05）。在一定范圍內(nèi)增加蚯蚓密度能有效促進西瓜生長，減緩枯萎病發(fā)生。在蚯蚓質(zhì)量相同的情況下，威廉環(huán)毛蚓的促生防病效果優(yōu)于赤子愛勝蚓。0～45 d的試驗過程中，試驗組土壤中西瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporum f.sp. niveum）數(shù)量、總酚酸含量較對照分別下降了36.63%～69.39%、31.0%～77.4%，45 d時試驗組的土壤微生物量碳含量、土壤脫氫酶活性較對照分別提高了115.10～175.71 mg/kg、1.41～2.40 μg/（g·h）。蚯蚓能有效降低西瓜植株枯萎病的發(fā)病率，促進植株生長，其防控機理可能為：蚯蚓的穴居、取食等活動直接抑制土壤中尖孢鐮刀菌的快速繁殖，同時蚯蚓通過降解土壤化感物質(zhì)（總酚酸），提升微生物總量和活性等方式調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，從而有效防控西瓜枯萎病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：西瓜枯萎病;蚯蚓;西瓜?；图怄哏牭毒?總酚酸;土壤微生物量碳;脫氫酶

中圖分類號：S651;S436.5文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0070-07

Abstract：In order to explore the influence mechanism of Pheretima guillelmi and Eisenia foetida on watermelon Fusarium wilt and develop new ideas for the controlling， pot experiments were conducted to study the effects of different densities of Pheretima guillelmi and Eisenia foetida on watermelon vine length， fresh weight and incidence of Fusarium wilt. In addition， the control mechanism was explored by combining with the dynamic changes of Fusarium oxysporum f.sp. niveum， total phenolic acid， microbial biomass carbon and dehydrogenase activity in soil. The results showed that the vine length and fresh weight of watermelon in the experimental groups increased by 18.57%-67.27% and 39.29%-87.24% compared with those in control group at the 45th day after planting. At the 30th and 45th days， the wilt incidence of watermelon in the control group was 62.15% and 85.32%， respectively， which was significantly higher than that in the earthworm experimental groups（P<0.05）. Increasing the earthworm density in a certain range could effectively promote the growth of watermelon and inhibit Fusarium wilt. Under the same weight， the growth and disease prevention effect of Pheretima guillelmi was better than that of Eisenia foetida. During the 0-45 days， the number of Fusarium oxysporum f.sp. niveum and total phenolic acid content in the soil of the earthworm experimental group decreased by 36.63%-69.39% and 31.0%-77.4%， respectively. At the 45th day， soil microbial biomass carbon and dehydrogenase activity in the earthworm experimental groups increased by 115.10-175.71 mg/kg and 1.41-2.40 μg/（g·h） compared with those in control group. Pheretima guillelmi and Eisenia foetida could effectively reduce the incidence of watermelon Fusarium wilt and promote plant growth. The mechanism may be that activities（ burrowing and feeding） of earthworms directly inhibited the rapid propagation of Fusarium oxysporum in soil， and earthworms controlled soil microbial community structure by degrading soil allelochemicals （total phenols）， increasing total microbial biomass and microbial activity. In conclusion， the soil micro-ecological environment was improved， and the occurrence of watermelon Fusarium wilt was effectively controlled.

Key words：watermelon Fusarium wilt;earthworm;Fusarium oxysporum f.sp. niveum;total phenolic acid;soil microbial biomass carbon;dehydrogenase

隨著耕地面積的減少，連作現(xiàn)象普遍增加，而連作模式破壞了土壤微生態(tài)環(huán)境，引起微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，導致嚴重的連作障礙[1-2]。西瓜連作障礙的主要病害為枯萎病，嚴重制約西瓜種植業(yè)的發(fā)展。目前，西瓜枯萎病的防治措施主要包括嫁接換根、化學防治、生物防治以及培育抗病品種等[3-5]，雖然有一定效果，但均存在一定的局限性，如西瓜品質(zhì)差，易造成二次污染等。

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師，蚯蚓在改善土壤理化性質(zhì)，推動養(yǎng)分循環(huán)，調(diào)控土壤微生物活性、群落結(jié)構(gòu)和功能等方面均具有重要作用[6]。蚯蚓可以促進植物生長，其數(shù)量也是表征土壤健康的重要指標[7-8]。關(guān)于蚯蚓對土壤微生態(tài)調(diào)控的研究很多，但是關(guān)于蚯蚓防控連作障礙的研究相對較少，并且主要集中在蚯蚓糞的功效研究[9]。Szczech[10]報道，生長介質(zhì)中蚯蚓糞的加入量與其對病原真菌的抑制效果正相關(guān)，但經(jīng)高溫滅菌后，蚯蚓糞的抑病性喪失，表明是生物因素在發(fā)揮作用。蚯蚓堆肥能明顯降低西瓜和番茄的枯萎病發(fā)病率，提高壯苗指數(shù)，改善品質(zhì)[11-12]。畢艷孟[13]通過研究蚯蚓對草莓枯萎病的防控效應，發(fā)現(xiàn)蚯蚓能有效降低草莓枯萎病的病情指數(shù)。西瓜連作后土壤微生態(tài)環(huán)境惡化，不利于西瓜生長。本試驗擬選取正蚓科食碎屑類表棲型的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）和巨蚓科食土類深棲型的威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）2種蚯蚓[6，14]，二者親緣關(guān)系較遠，同時前者為常見的養(yǎng)殖種，后者為自然環(huán)境中常見的野生種，具有一定的典型性和代表性。采用不同密度的赤子愛勝蚓和威廉環(huán)毛蚓，在連作5年的西瓜土壤中預培育90 d后移栽西瓜苗，調(diào)查西瓜長勢和枯萎病的發(fā)病率，同時監(jiān)測土壤微生物量碳含量、脫氫酶活性、總酚酸含量、西瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）數(shù)量等的動態(tài)變化，旨在探索蚯蚓對西瓜枯萎病的防控效果及其機理，以期為西瓜枯萎病的防控提供理論依據(jù)和新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試土壤取自上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行試驗站西瓜連作5年的大棚，西瓜連作障礙嚴重，其西瓜枯萎病的發(fā)病率在60%以上。在2018年3月取0～20 cm土壤，按照一定比例（土壤∶牛糞=9∶1，質(zhì)量比）在連作土壤中添加牛糞，為蚯蚓和西瓜的生長提供餌料和養(yǎng)分。試驗土壤基本性狀：pH 7.72、電導率1.18 mS/cm、有機質(zhì)含量18.1 g/kg、全氮含量1.46 g/kg、全磷含量2.04 g/kg、全鉀含量15.83 g/kg 、速效氮含量80.39 mg/kg、速效磷含量85.93 mg/kg、速效鉀含量640.03 mg/kg。牛糞基本性狀：水分含量39.46%、有機質(zhì)含量42.20 g/kg、全氮含量8.82 g/kg、全磷含量7.38 g/kg、全鉀含量5.88 g/kg。

供試蚯蚓赤子愛勝蚓（太平2號）購自江蘇無錫的養(yǎng)殖基地，威廉環(huán)毛蚓取自于上海市農(nóng)業(yè)科學院崇明試驗基地。試驗前先將2種蚯蚓放入試驗土壤中預培養(yǎng)7 d，以便蚯蚓適應試驗土壤環(huán)境，同時用試驗土壤替代蚯蚓體內(nèi)原有的內(nèi)容物，減少試驗誤差。挑選長勢均勻，單體質(zhì)量分別為3.0～3.5 g的威廉環(huán)毛蚓和0.3～0.4 g的赤子愛勝蚓為試驗蚯蚓。

采用直徑30 cm、高40 cm的圓柱形鐵桶作為試驗容器，底部打4個孔，四周打6個孔，底部和四周打孔處內(nèi)附50目細紗網(wǎng)，鐵桶上口同樣采用50目細紗網(wǎng)覆蓋，防止蚯蚓爬出。

供試西瓜品種為早春紅玉，幼苗苗齡為30 d，具有3～4片真葉時選取葉片寬厚無損、色濃健壯的西瓜苗進行定植。溫室溫度20～30 ℃，西瓜苗大概每隔5 d澆一次水，保證土壤含水量在20%左右。

1.2試驗設(shè)計

每個試驗容器底部放入100 g水稻秸稈（長約5 cm）和1 kg新鮮菜葉后，加入5 kg試驗土壤，加入1 000 ?ml水，平衡24 h后投放蚯蚓。試驗中蚯蚓密度的設(shè)置，以15 d 1 kg土壤中蚯蚓存活率超過99%的密度為上限，結(jié)合田間蚯蚓密度調(diào)查結(jié)果，同時為減少蚯蚓單體質(zhì)量差異和個體數(shù)量的影響，選用單體質(zhì)量分別為3.0～3.5 g的威廉環(huán)毛蚓和0.3～0.4 g的赤子愛勝蚓為試驗蚓種，并且以條數(shù)為蚯蚓密度的計量單位，具體試驗設(shè)置如下：不投放蚯蚓（CK），1 kg土壤投放1條、3條、5條威廉環(huán)毛蚓的P1、P3、P5處理，1 kg土壤投放5條、10條、15條赤子愛勝蚓E5、E10、E15的處理。由于2種蚯蚓單體質(zhì)量差異較大，設(shè)置了一組（P1和E10）2種蚯蚓質(zhì)量相同的試驗處理，以便進行對比，投放蚯蚓后在容器表面放置20 g水稻秸稈（長約5 cm），為蚯蚓提供遮光環(huán)境，溫室溫度為25～30 ℃，相對濕度為70%～80%。培育90 d后，選取長勢相似的西瓜幼苗移栽至試驗盆中，每盆5株，每個處理15盆。西瓜定植0 d起，間隔15 d采用5點法采集0～20 cm的試驗土壤，測定相關(guān)指標，同時從西瓜定植15 d起，每15 d統(tǒng)計一次西瓜長勢和枯萎病發(fā)病率，當對照的發(fā)病率達到80%以上時，結(jié)束試驗。

1.3測定方法

1.3.1西瓜植株長勢指標的測定隨機取3盆西瓜，采用米尺測量主蔓長，同時將西瓜苗整體挖出后，洗凈根部土壤，用濾紙吸干西瓜植株上的水分，然后稱量鮮質(zhì)量。

1.3.2西瓜枯萎病發(fā)病率的測定西瓜枯萎病參照文獻[15]的方法進行鑒別，并記錄西瓜枯萎?。菸~片數(shù)≥50%）發(fā)病株數(shù)，以發(fā)病植株占總株數(shù)的百分比表示發(fā)病率。

1.3.3土壤測定項目與方法西瓜?；图怄哏牭毒捎脽晒舛縋CR法測定[16]，土壤微生物量碳采用熏蒸提取-重鉻酸鉀氧化法測定[17]，土壤脫氫酶活性采用2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）分光光度法測定[18]，土壤總酚酸含量采用福林酚比色法測定[13，19]。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，均值比較采用最小顯著性差異法（LSD）進行分析，顯著水平為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1蚯蚓對西瓜長勢的影響

圖1顯示，2種蚯蚓對西瓜主蔓長和鮮質(zhì)量均有顯著的促進作用，45 d時試驗組主蔓長、鮮質(zhì)量較對照分別增加了18.57%～67.27%、39.29%～87.24%。西瓜的長勢與蚯蚓的密度和種類相關(guān)，同種蚯蚓，高密度處理的西瓜長勢優(yōu)于低密度處理（P<0.05），但是P3與P5、E5與E10處理間的差異均不顯著。蚯蚓質(zhì)量相同情況下，威廉環(huán)毛蚓（P1）處理的西瓜長勢優(yōu)于赤子愛勝蚓（E10）處理。

2.2蚯蚓對西瓜植株枯萎病發(fā)病率的影響

圖2顯示，西瓜定植后15 d，植株枯萎病的發(fā)病率低于3.00%，定植后30 d的發(fā)病率高于34.93%，其中CK的發(fā)病率為62.15%，顯著高于蚯蚓試驗組（P<0.05）;定植后45 d，CK的西瓜植株枯萎病發(fā)病率增長至85.32%，而試驗組的發(fā)病率較30 d時僅略有增長?？菸〉陌l(fā)病率與蚯蚓的密度成反比，但是P3與P5、E5與E10處理間的差異均不顯著。蚯蚓質(zhì)量相同情況下，威廉環(huán)毛蚓處理（P1）的枯萎病發(fā)病率低于赤子愛勝蚓（E10）處理。

2.3蚯蚓對土壤中西瓜?；图怄哏牭毒鷶?shù)量的影響

圖3顯示，在0～45 d的試驗過程中，蚯蚓試驗組土壤中的西瓜專化型尖孢鐮刀菌數(shù)量較對照下降了36.63%～69.39%。土壤中西瓜專化型尖孢鐮刀菌的數(shù)量與蚯蚓的密度總體成反比，但是P3與P5、E5與E10處理間的差異均不顯著。45 d時，蚯蚓質(zhì)量相同情況下，P1處理的土壤中西瓜專化型尖孢鐮刀菌數(shù)量較E10處理降低了19.76%。

2.4蚯蚓對土壤微生物總量和微生物活性的影響

分別以土壤微生物量碳含量、土壤脫氫酶活性表征土壤微生物總量、土壤微生物活性，結(jié)果（圖4、圖5）顯示，CK的土壤微生物量碳含量、土壤脫氫酶活性與試驗組差異顯著（P<0.05）。45 d時，蚯蚓試驗組土壤微生物量碳含量、土壤脫氫酶活性較CK提高了115.10～175.71 mg/kg、1.41～2.40 μg/（g·h）。在整個試驗過程中，CK的土壤微生物量碳含量、土壤脫氫酶活性分別為273.49～287.31 mg/kg、2.76～2.97 μg/（g·h）。0～45 d的取樣過程中，蚯蚓試驗組土壤微生物量碳含量總體呈先上升后下降的趨勢，而土壤脫氫酶活性呈上升趨勢，但30 d后P3、P5處理的土壤脫氫酶活性呈平穩(wěn)狀態(tài)。土壤微生物量碳含量和脫氫酶活性與蚯蚓的種類和密度相關(guān)，同種蚯蚓土壤微生物量碳含量和脫氫酶活性總體隨蚯蚓密度的增大而升高，但是P3與P5、E5與E10處理間的差異均不顯著。蚯蚓質(zhì)量相同情況下，P1處理的土壤微生物量碳含量和脫氫酶活性均高于E10處理。

2.5蚯蚓對土壤總酚酸含量的影響

圖6顯示，整個試驗過程中，蚯蚓試驗組土壤中總酚酸含量較CK下降了31.0%～77.4%，隨時間增加，CK的土壤總酚酸含量呈上升趨勢，尤其30 d土壤總酚酸含量上升明顯，這可能與30 d時CK的西瓜植株枯萎病發(fā)病率大幅增加，西瓜植株腐解產(chǎn)生酚類物質(zhì)有關(guān)。比較2種蚯蚓處理組之間的土壤總酚酸含量，發(fā)現(xiàn)蚯蚓質(zhì)量相同情況下，威廉環(huán)毛蚓處理P1的土壤總酚酸含量低于赤子愛勝蚓處理E10。同種蚯蚓處理之間土壤總酚酸含量與蚯蚓密度呈負相關(guān)，但是P3與P5、E5與E10處理間差異均不顯著。

3討論

3.1蚯蚓選取及生存狀況

試驗結(jié)束后，土壤表面有大量蚓糞，統(tǒng)計土壤中蚯蚓的數(shù)量發(fā)現(xiàn)投放赤子愛勝蚓的土壤中存在大量幼蚓，而投放威廉環(huán)毛蚓的土壤中蚯蚓數(shù)量基本沒有變化，間接說明各個密度的蚯蚓均能很好地適應試驗土壤。

3.2蚯蚓對西瓜長勢和枯萎病發(fā)病率的影響

蚯蚓對植物生長有促進作用[20-22]。目前的報道主要集中在蚯蚓糞功效的研究，將蚯蚓直接應用于植物連作障礙防治的研究相對較少。有研究結(jié)果[11-12，23]表明，蚯蚓堆肥能促進植物生長，降低發(fā)病率。本試驗發(fā)現(xiàn)，在西瓜連作土壤系統(tǒng)中，蚯蚓不僅促進了西瓜的生長，還降低了枯萎病的發(fā)病率，這與畢艷孟[13]的結(jié)論一致。蚯蚓促進植物生長主要通過增加養(yǎng)分的可利用性[22]，以及提高植物光合速率[13]等途徑來實現(xiàn)。蚯蚓密度與西瓜長勢正相關(guān)，與枯萎病的發(fā)病率負相關(guān)，但P3與P5處理間差異不顯著，說明環(huán)境的容納能力有限，威廉環(huán)毛蚓防控效果不會隨密度的增大無限放大。赤子愛勝蚓E15處理的防控效果明顯優(yōu)于E5處理和E10處理，而E5處理與E10處理間差異不顯著，說明枯萎病防控的最佳密度與蚯蚓的品種相關(guān)，這可能與蚯蚓的生活型有關(guān)。蚯蚓質(zhì)量相同情況下，威廉環(huán)毛蚓P1處理的西瓜長勢及枯萎病防控效果均優(yōu)于赤子愛勝蚓E10處理，這也間接驗證了枯萎病防控的最佳密度與蚯蚓種類相關(guān)的這一結(jié)論。

3.3蚯蚓防控西瓜連作障礙的機理初探

在連作環(huán)境中，連作障礙的發(fā)生與化感物質(zhì)的積累以及土壤微生物群落失衡有關(guān)[24-25]。西瓜連作障礙的主要病害為西瓜專化型尖孢鐮刀菌引起的枯萎病，在0～45 d的試驗過程中，西瓜?；图怄哏牭毒臄?shù)量呈上升趨勢，但是蚯蚓試驗組西瓜專化型尖孢鐮刀菌的數(shù)量顯著低于CK，這可能與蚯蚓活動以及取食偏好有關(guān)。Shan等[26]通過同位素標記法證實，相對于細菌，威廉環(huán)毛蚓偏好取食真菌，除了取食外，蚯蚓的穴居同樣擾動了真菌菌絲體的生長[27]。西瓜定植后15 d，同一處理在不同取樣時間下的西瓜?；图怄哏牭毒鷶?shù)量差異不顯著，而西瓜枯萎病在西瓜定植后30 d左右暴發(fā)，之后蚯蚓試驗組的發(fā)病率較平穩(wěn)，這可能與蚯蚓影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。枯萎病的發(fā)病率與尖孢鐮刀菌數(shù)量直接相關(guān)，但是發(fā)病相對滯后，這可能與病原菌侵染過程中土壤微生態(tài)環(huán)境的影響及西瓜植株防御反應有關(guān)。

蚯蚓對土壤微生物總量和活性有重要的調(diào)控作用[12]。大量研究結(jié)果表明，蚯蚓的活動能增加土壤微生物總量并增強其活性[1，13，20，23，28-29]，本試驗也得出了相似的結(jié)果。但是，微生物總量和活性與蚯蚓的密度和品種相關(guān)，一定范圍內(nèi)提高蚯蚓密度能增加土壤微生物總量和活性，這可能與相同生態(tài)環(huán)境對不同生活型蚯蚓的容納能力不同有關(guān)。蚯蚓質(zhì)量相同時，威廉環(huán)毛蚓P1試驗組土壤微生物總量和活性均顯著高于赤子愛勝蚓E10試驗組，這與前人的研究結(jié)果[13]相似。但也有研究結(jié)果表明，蚯蚓活動會降低土壤微生物總量，如Zhang等[30]指出，在土壤中接種威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓24 h后，土壤中微生物量均顯著下降;Gomez-Brandon等[31]研究安德愛勝蚓腸道時，發(fā)現(xiàn)糞便中微生物量低于食物中的量，這可能與研究時長及研究環(huán)境不同有關(guān)。

植物根系分泌及其殘體腐解產(chǎn)生的化感物質(zhì)會影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[32-33]，而酚酸類物質(zhì)作為土壤中重要的化感物質(zhì)對土壤病原菌的生長有促進作用[9]。Bi等[34]報道，蚯蚓能顯著降低連作草莓土壤中酚酸含量，這與本試驗的結(jié)果一致。本試驗中，隨著時間的延長，對照的土壤總酚酸含量呈上升趨勢，西瓜定植后45 d時總酚酸含量高于西瓜定植后30 d時總酚酸含量，這可能與西瓜定植后30 d左右暴發(fā)式發(fā)病后，殘體增多有關(guān)。試驗組土壤總酚酸含量呈下降趨勢，這可能與蚯蚓培育土壤過程中持續(xù)降解酚酸，使土壤總酚酸含量維持在較低水平有關(guān)，蚯蚓是通過調(diào)控土壤微生物來降解酚酸類物質(zhì)的[34]，因此土壤總酚酸含量在一定水平內(nèi)維持相對穩(wěn)定，可以減弱其對病原菌的促生誘導。

綜上所述，西瓜連作土壤系統(tǒng)中西瓜、土壤微生物、蚯蚓相互影響，蚯蚓防控西瓜的連作障礙，可能主要是通過降解化感物質(zhì)，減緩西瓜分泌物或殘體降解物（酚酸類）對病原微生物的定向促進，同時通過穴居、取食等活動抑制病原菌的快速繁殖，加速有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進微生物總量和活性的增加，進而改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的。Janvier等[35]認為，在健康土壤中，植物病原菌受到土壤生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部各種作用的制約，種群不會無限制擴大，因此不會引起植物大規(guī)模病害的暴發(fā)，與本試驗的結(jié)論一致。

威廉環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓能有效降低西瓜枯萎病的發(fā)病率，促進植株生長。在一定范圍內(nèi)增加蚯蚓密度能更好地促進植物生長，降低西瓜枯萎病的發(fā)病率，并且在蚯蚓質(zhì)量相同的情況下，威廉環(huán)毛蚓的防控效果優(yōu)于赤子愛勝蚓。

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（責任編輯：王妮）