復(fù)黃片微生物限度檢查方法適用性探究

胡亞英馬 欣陳 睿陸金根邱明豐潘一濱?張 平?

（1.上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海201600； 2.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032）

制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)目中的微生物限度檢查是保障藥品使用安全的重要指標(biāo)之一［1-3］，中藥制劑微生物污染的限度是中藥制劑臨床應(yīng)用是否安全有效的一項(xiàng)重要參數(shù)［4］?！吨袊?guó)藥典》 明確提出所有用于藥品質(zhì)量控制的微生物檢驗(yàn)方法，應(yīng)先進(jìn)行方法驗(yàn)證，以避免方法不適而造成的漏檢、誤判［5］。2015 年版《中國(guó)藥典》（四部）［6］將微生物檢查計(jì)數(shù)法完善成為更加科學(xué)與國(guó)際接軌的檢查方法［7］。明確方法的選擇應(yīng)考慮供試品的處方工藝、抑菌程度、用藥途徑等因素，擬定檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，確認(rèn)檢驗(yàn)方法可行、有效［8］。中成藥由于組成多樣，大多具有消炎抗菌作用［9-11］，文獻(xiàn)研究較多［1，12-13］，微生物檢測(cè)方法的適用性試驗(yàn)就顯得更為重要［14-16］，且其結(jié)果直接影響微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性［8］。

復(fù)黃片是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院和上海交通大學(xué)藥學(xué)院共同研發(fā)基礎(chǔ)上開發(fā)的中藥6 類新藥，由蒲黃炭、槐角、地榆炭及大黃組成，功能涼血止血、清熱通便，主治血熱妄行之便血［17-18］。根據(jù)其給藥途徑和處方工藝，按2015 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則1107 規(guī)定，不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度檢查項(xiàng)目為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌大腸埃希菌的檢查。本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)黃片進(jìn)行循序漸進(jìn)的適用性研究，并對(duì)3 批復(fù)黃片進(jìn)行3 次獨(dú)立試驗(yàn)，建立微生物限度檢查方法。

1 材料

C 級(jí)背景局部A 級(jí)的凈化工作臺(tái)、HTY-602A 集菌儀、FC752 型薄膜過(guò)濾器、HTY-761 勻漿儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌鍋（日本Panasonic 公司）；PL402-L 電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KS12 生物安全柜（美國(guó)Thermo 公司）；BD400 微生物培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder 公司）。對(duì)照品金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］均來(lái)源于北京三藥科技開發(fā)公司；對(duì)照品黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］均來(lái)源于杭州微球生物技術(shù)有限公司。

pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；氯化鈉（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

復(fù)黃片（批號(hào)1711001、1711002、1711003），由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供委托上海寶龍藥業(yè)有限公司配制。

2 方法與結(jié)果

2.1 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 d，白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 d，需氧菌總數(shù)平板培養(yǎng)溫度30～35 ℃，霉菌和酵母菌總數(shù)平板培養(yǎng)溫度20～25 ℃，菌落數(shù)接種量均不得大于100 cfu。按以下公式進(jìn)行回收試驗(yàn)比值計(jì)算。

2.1.1 菌液制備 根據(jù)菌種說(shuō)明書，將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成混懸液，使加入供試品溶液中的含菌落數(shù)≤100 cfu／mL。

2.1.2 供試品溶液制備 取供試品10 g，以pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，稀釋至100 mL，經(jīng)勻漿儀粉碎，制成1∶10 供試品溶液。

2.1.3 平皿傾注法（常規(guī)法）制備6 份1∶10 供試品溶液。5 份分別加入5 種試驗(yàn)菌混懸液（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉），使每1 mL 供試品溶液中含菌量不大于100 cfu，作為實(shí)驗(yàn)組；另一份作為供試品對(duì)照組。以稀釋液替代供試品溶液，按照實(shí)驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液，作為菌液對(duì)照組。振蕩均勻后，分別移取1 mL 至2 個(gè)相應(yīng)的無(wú)菌平皿（?90 mm）中，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基。

需氧菌總數(shù)中試驗(yàn)菌銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌比值不在0.5～2 規(guī)定范圍內(nèi)，供試品有抑菌性，故進(jìn)一步采用消除抑菌性的方法。霉菌和酵母菌總數(shù)中，試驗(yàn)菌白色念珠菌、黑曲霉比值均在0.5～2 規(guī)定范圍內(nèi)，霉菌和酵母菌總數(shù)方法可使用平皿傾注法（?90 mm，1 mL／皿），見表1。

表1 需氧菌、霉菌、酵母菌總數(shù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（平皿傾注法，1∶10 供試品溶液，1 mL／皿， n＝2）

2.1.4 平皿傾注法（稀釋法）只做需氧菌總數(shù)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備實(shí)驗(yàn)組、供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組。分別移取0.1 mL 至10 個(gè)相應(yīng)的無(wú)菌平皿（?150 mm）中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌比值不在0.5～2 規(guī)定范圍內(nèi)，供試品的抑菌性未完全消除，見表2。

表2 需氧菌總數(shù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（平皿傾注稀釋法，1∶10 供試品溶液，0.1 mL／皿， n＝10）

2.1.5 薄膜過(guò)濾法 只做需氧菌總數(shù)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取1∶10 的供試品溶液1 mL，薄膜（直徑75 mm，孔徑0.45 μm）過(guò)濾，沖洗量100 mL，在最后1 次沖洗的同時(shí)加入含菌量不大于100 cfu 的試驗(yàn)菌液混勻，濾過(guò)，作為實(shí)驗(yàn)組；以稀釋液代替菌液，作為供試品對(duì)照組；以稀釋液代替供試品溶液，作為菌液對(duì)照組。轉(zhuǎn)移濾膜以菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上（?90 mm），每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿。試驗(yàn)菌的回收率比值均在0.5～2 規(guī)定范圍內(nèi)，薄膜過(guò)濾法（100 mL 沖洗量，1 mL／膜）用于需氧菌總數(shù)測(cè)定，見表3。

表3 需氧菌總數(shù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（薄膜過(guò)濾法，1∶10 供試品溶液，沖洗量100 mL， n＝2）

2.1.6 結(jié)果 取3 批復(fù)黃片（批號(hào)1711001、1711002、1711003），進(jìn)行3 次獨(dú)立試驗(yàn)。需氧菌總數(shù)按薄膜過(guò)濾法（1∶10 供試品溶液，1 mL／膜，沖洗量100 mL）進(jìn)行5 種菌加菌回收試驗(yàn)，澆注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；霉菌及酵母菌總數(shù)按平皿傾注法（1∶ 10 供試品溶液，1 mL／皿，?90 mm）進(jìn)行2 種菌加菌回收試驗(yàn)，澆注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）?；厥章时戎稻?.5～2 之間，表明方法可行，見表4。

表4 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)適用性試驗(yàn)結(jié)果（n＝2）

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 菌液制備 根據(jù)菌種說(shuō)明書，將大腸埃希菌用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成混懸液，使加入供試品液中的菌落數(shù)≤100 cfu。

2.2.2 供試品溶液制備 同“2.1.2”項(xiàng)，制成1∶10溶液。

2.2.3 適用性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取1∶10 供試品溶液10 mL 及不大于100 cfu 試驗(yàn)菌的菌懸液（大腸埃希菌），分別接種至100、200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，作為實(shí)驗(yàn)組1～2；以稀釋液代替菌液，作為供試品對(duì)照組；以稀釋液代替供試品溶液，作為菌液對(duì)照組。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物30～35 ℃培養(yǎng)18 h 后，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44 ℃培養(yǎng)24 h；取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。

2.2.4 適用性試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組1 以100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為增菌液，麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板上都出現(xiàn)弱陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)組2 以200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為增菌液，陽(yáng)性明顯，菌落生長(zhǎng)較好，故采用培養(yǎng)基稀釋法，以200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為增菌液體積，結(jié)果見表5。

表5 大腸埃希菌控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 結(jié)果 取3 批復(fù)黃片（批號(hào)1711001、1711002、1711003），進(jìn)行3 次獨(dú)立試驗(yàn)。以200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為增菌液，培養(yǎng)基稀釋法方法可行，見表6。

2.3 結(jié)論 按“2.1.6”“2.2.5”項(xiàng)下微生物限度檢驗(yàn)方法，對(duì)3 批樣品進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果見表7。3 批樣品的需氧菌總數(shù)均＜10 cfu／g、霉菌和酵母菌總數(shù)均＜10 cfu／g，未檢出控制菌大腸埃希菌，符合2015 年版《中國(guó)藥典》 四部對(duì)不含藥材原粉的中藥固體口服制劑的限度要求。

表6 大腸埃希菌控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表7 3 批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

2015 年版《中國(guó)藥典》 與2010 年版相比較，修訂內(nèi)容比較多。首先，關(guān)于加菌實(shí)驗(yàn)組的制備有修訂。后者加菌試驗(yàn)是“取供試品溶液與試驗(yàn)菌菌液，分別注入平皿，菌液在培養(yǎng)基搖碟時(shí)與供試品溶液相接觸”，而前者是“取已經(jīng)制備好的供試品溶液，加入試驗(yàn)菌，混勻，菌液在供試品溶液的制備過(guò)程即與供試品溶液直接混勻接觸，充分模擬樣品的污染狀態(tài)”。把試驗(yàn)菌加入供試品溶液中一起混勻制備，更加真實(shí)地反映樣品的染菌狀態(tài)，也增加了試驗(yàn)操作的難度［19］。其次，前者刪除離心沉淀法。《中國(guó)藥典分析檢測(cè)技術(shù)《中國(guó)藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南》 》［20］中明確指明此法能將吸附有微生物的顆粒劑懸浮微生物沉積到離心管底部，影響微生物的檢出，所以各國(guó)藥典均未收載該方法。文獻(xiàn)［21］采用離心沉淀法建立復(fù)黃片微生物限度檢查方法，2015 年版《中國(guó)藥典》（四部）頒布以后，該方法已不適用。

本品由蒲黃炭、槐角、地榆炭及大黃4 味藥組成，其中大黃具有較強(qiáng)的抑菌活性［22-23］。蘇潤(rùn)萍［24］關(guān)于驗(yàn)證方法的選擇中認(rèn)為，常規(guī)法＞稀釋法＞中和法＞薄膜過(guò)濾法＞幾種方法聯(lián)合使用。本研究在選擇方法時(shí)從常規(guī)法到稀釋法開始摸索，測(cè)定需氧菌總數(shù)時(shí)采用1∶10 稀釋的供試品溶液平皿傾注法，不管是用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積，都無(wú)法消除供試品的抑菌性。中成藥的抑菌性無(wú)法選擇合適的中和劑消除抑菌性，薄膜過(guò)濾法能直接徹底消除抑菌作用、計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確度高，但是不適用于非完全溶解的供試品。對(duì)于大多數(shù)的中成藥固體制劑而言，處方中不溶性成分較多，不能使用離心沉淀來(lái)減少藥渣的堵膜影響，薄膜過(guò)濾法的使用難以確保方法的可操作性［19］。本實(shí)驗(yàn)摸索了直徑50、75 mm 濾膜的操作性，直徑75 mm 濾膜很好的解決了樣品固體顆粒堵膜的障礙，過(guò)濾快；摸索了100、200 mL沖洗量的試驗(yàn)菌回收率比值結(jié)果，均在0.5～2.0 之間，故選用沖洗量100 mL，操作快速高效。

采用標(biāo)準(zhǔn)定量菌株，菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確方便可控，減少了藥典規(guī)定中菌液制備的繁瑣過(guò)程。pH 7.2 磷酸鹽緩沖液作為稀釋劑［25-27］，其具有穩(wěn)定微生物細(xì)胞滲透壓，緩沖供試品溶液pH，提供適于微生物生長(zhǎng)的環(huán)境［28］。培養(yǎng)時(shí)間按藥典規(guī)定最短時(shí)間計(jì)數(shù)，應(yīng)逐天觀察，黑曲霉生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 d，一般在第2～3 天時(shí)就可以計(jì)數(shù)，培養(yǎng)至第4 天后蔓延成片不易計(jì)數(shù)；白色念珠菌生長(zhǎng)較緩慢，不管在TSA 還是SDA 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 d 即可計(jì)數(shù)。另外，以稀釋液作為空白，計(jì)數(shù)與控制菌檢查均應(yīng)顯陰性，否則實(shí)驗(yàn)失敗，需重新實(shí)驗(yàn)。