HPLC 法同時測定大果飛蛾藤中8 種成分

胡 靜崔小敏楊媛媛任 慧田 歡石會麗陳志永?

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安710061； 2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安710003； 3.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安710054）

大果飛蛾藤Porana sinensisHenmsl.為旋花科飛蛾藤屬植物，又稱異萼飛蛾藤，廣泛分布于我國的華南、西南、華中及甘肅南部地區(qū)［1-3］。飛蛾藤屬植物在民間作為藥用的記載較少，僅《中藥大辭典》 記載飛蛾藤Porana racemosaRoxb.可用于無名腫痛、勞傷疼痛及高燒的治療［4］。丁公藤Erycibe obtusifoliaBenth.為我國傳統(tǒng)民間用藥，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功效［5-7］，是祛風(fēng)濕中藥馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的君藥［8-9］。近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化以及臨床需求量的快速增長，丁公藤藥材已不能滿足人們的用藥需求，大果飛蛾藤現(xiàn)已成為丁公藤的主流替代品種及《中國藥典》 所載丁公藤的代用品［1，10］。

Chen 等［11］通過對丁公藤和大果飛蛾藤抗炎、鎮(zhèn)痛功效，化學(xué)成分及生物活性3 方面的比較研究，證明兩者都含有大量的綠原酸類和香豆素類，40%乙醇提取物都具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，口服給藥安全性高。楊媛媛等［2］初步制定了大果飛蛾藤的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立了大果飛蛾藤中東莨菪苷、綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的含有量測定方法，但該方法忽視了大果飛蛾藤中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸等具有廣泛生物活性且含有量較高的成分。本研究首次建立HPLC 法同時測定大果飛蛾藤中新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量，以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 系列高效液相色譜儀，配置VWD檢測器和Agilent Chem Station 工作站（美國Agilent公司）；KQ-100 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；BS210S 型電子分析天平（萬分之一，北京賽多利斯天平有限公司）；BT25S 型電子分析天平（十萬分之一，北京賽多利斯天平有限公司）。

對照品東莨菪苷（批號16040805，純度≥98%）、東莨菪內(nèi)酯（批號161208，純度≥98%）、綠原酸（批號1701904，純度≥98%）、隱綠原酸（批號17061401，純度≥98%）、新綠原酸（批號17062003，純度≥98%）、異綠原酸A（批號18090301，純度≥98%）、異綠原酸B（批號17121201，純度≥98%）和異綠原酸C（批號18070401，純度≥98%）購自上海圻明生物科技有限公司。水為超純水，乙腈為色譜純試劑（美國Thermo Fisher 公司），其他試劑均為分析純。

大果飛蛾藤藥材批次1、6、8 為當(dāng)?shù)夭墒?，其他批次藥材均為產(chǎn)地購買。大果飛蛾藤藥材所有批次樣品經(jīng)陜西省中醫(yī)醫(yī)院石會麗研究員鑒定為旋花科飛蛾藤屬植物大果飛蛾藤Porana sinensisHenmsl.的干燥藤莖，信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent 5TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～15% A；15～70 min，15%～25% A；70～90 min，25% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長345 nm；進(jìn)樣量10 μL。在本色譜條件下，大果飛蛾藤中8 種成分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 供試品溶液制備 精密稱取不同批次的樣品粉末0.5 g（過40 目篩），置100 mL 具塞錐形瓶中。精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量。常溫下超聲處理30 min，放冷，用80% 甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量。搖勻，過濾，取續(xù)濾液5 mL 轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，40%甲醇定容至刻度。過0.45 μm 微孔濾膜即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于8 個10 mL 量瓶中，加甲醇制成含綠原酸0.97 mg／mL、隱綠原酸0.68 mg／mL、新綠原酸0.38 mg／mL、異綠原酸A 0.62 mg／mL、異綠原酸B 1.16 mg／mL、異綠原酸C 0.55 mg／mL、東莨菪苷0.32 mg／mL、東莨菪內(nèi)酯0.81 mg／mL 的對照品貯備液；精密量取上述對照品溶液各2 mL，混勻即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品貯備液0.2、0.5、1、5、10 mL，用甲醇分別定容至10 mL 量瓶。在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.3”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣6 次，測得東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 和異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.88%、0.55%、0.55%、1.02%、1.21%、0.89%、0.76%、0.40%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.72%、0.51%、0.82%、0.54%、1.31%、0.52%、1.43%、0.61%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一供試樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行6 份，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣。測得新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C 峰面積RSD 分別為1.88%、1.69%、1.71%、1.13%、1.61%、1.44%、1.53%、1.78%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知8 個化合物含有量的大果飛蛾藤樣品0.25 g，共稱取6 份，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，分別精密加入各對照品適量。按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，計算各待測成分的加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測定 分別取8 批大果飛蛾藤粉末各0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，計算8 種成分的含有量。結(jié)果見表4。

由表4 可知，8 批大果飛蛾藤中新綠原酸含有量在0.183 6～0.342 8 mg／g 之間，東莨菪苷含有量在0.516 2～1.070 3 mg／g 之間，綠原酸含有量在0.525 8～0.917 3 mg／g 之間，隱綠原酸含有量在0.194 0～0.350 8 mg／g 之間，東莨菪內(nèi)酯含有量在0.146 6～0.315 3 mg／g 之間，異綠原酸B 含有量在0.406 9～0.776 1 mg／g 之間，異綠原酸A 含有量在0.361 6～0.725 2 mg／g 之間，異綠原酸C 含有量在0.508 5～0.993 4 mg／g 之間；擬定各成分含有量最小值降低20%為含有量限度，待今后積累更多數(shù)據(jù)再做修訂。則大果飛蛾藤藥材中新綠原酸含有量不得少于0.146 9 mg／g，東莨菪苷含有量不得少于0.413 0 mg／g，綠原酸含有量不得少于0.420 6 mg／g，隱綠原酸含有量不得少于0.155 2 mg／g，東莨菪內(nèi)酯含有量不得少于0.117 3 mg／g，異綠原酸B 含有量不得少于0.325 5 mg／g，異綠原酸A 含有量不得少于0.289 3 mg／g，異綠原酸C 含有量不得少于0.406 8 mg／g。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗分別考察了甲醇和乙腈作為有機(jī)相對樣品分離度的影響，乙腈-水分離效果明顯較好；考察了不同濃度甲酸、磷酸對分離效果的影響，結(jié)果磷酸較甲酸分離效果好，最終選擇0.1%磷酸溶液作為水相。綜上所述，以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫時基線穩(wěn)定，峰型和分離度比較好，故選擇其作為流動相。

3.2 檢測波長選擇 據(jù)文獻(xiàn)查閱和2015 年版《中國藥典》 一部中東莨菪內(nèi)酯和綠原酸類的紫外檢測波長分別為298 nm［5］和327 nm［12-14］；本實驗在實際操作中考察了287、300、327、345、360 nm等多個波長條件下的出峰情況，發(fā)現(xiàn)在345 nm 條件下峰型好、分離度高，同時兼具了紫外吸收強(qiáng)等特點，故確定345 nm 為檢測波長［6］。

3.3 指標(biāo)性成分選取 本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)大果飛蛾藤中含有大量的綠原酸類和香豆素類成分，尤其是3，4-二咖啡?？崴帷?，5-二咖啡?？崴帷?，5-二咖啡?？崴岬仍诖蠊w蛾藤中含有量較高［15］。二咖啡?？崴犷惓煞志哂锌寡祝?1，16］、抗氧化［17］等生理活性，而抗炎、抗氧化活性與大果飛蛾藤的抗風(fēng)濕藥效緊密相關(guān)。將二咖啡酰奎尼酸類成分作為大果飛蛾藤的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分具有可行性。

本研究建立了8 種有效成分含有量的測定方法，該方法選取大果飛蛾藤中含有量較高且與大果飛蛾藤臨床藥效緊密相關(guān)的8 種成分作為指標(biāo)性成分，以期所建立的多指標(biāo)含有量測定方法有助于提升大果飛蛾藤質(zhì)量控制水平，保證其臨床應(yīng)用的有效性和安全性。