補(bǔ)肝益腎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張靖年畢曉黎胥愛麗李養(yǎng)學(xué)李素梅藍(lán)森梅

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院／廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510095；2.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東 廣州510520）

補(bǔ)肝益腎顆粒原方系廣東省第二中醫(yī)院骨科專家常用的臨床驗(yàn)方，由淫羊藿、山藥、續(xù)斷、白芍、澤瀉、制何首烏等8 味中藥組成，方中淫羊藿補(bǔ)肝腎之陽［1］，為君藥。 溫性之杜仲［2］、續(xù)斷［3］、桑寄生［4］為臣藥，能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。 佐以制何首烏補(bǔ)益精血［5］，澤瀉利濕而泄腎濁［6］，白芍柔肝斂陰［7］。 全方肝腎同補(bǔ)，補(bǔ)中寓泄，共奏補(bǔ)益肝腎作用。 該方臨床療效良好，但湯劑存在煎煮、攜帶、使用不方便的特點(diǎn)。 現(xiàn)將其制成顆粒劑，既保持原湯劑的特色和優(yōu)勢，又具有體積小、利于儲(chǔ)藏、便于攜帶、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。 但該制劑目前尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為較好地控制其質(zhì)量以保證臨床療效，本試驗(yàn)采用TLC 法定性鑒別方中君藥淫羊藿、佐藥白芍、制何首烏等藥味。研究表明，淫羊藿苷具有改善骨代謝、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用［8-9］，還可改善生殖功能［10-11］、保護(hù)腎臟［12］；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對成骨分化具有促進(jìn)作用［13-14］，并具有一定的肝臟保護(hù)作用［15-16］，這與補(bǔ)肝益腎顆粒的功效有一定的關(guān)聯(lián)性。 因此，本試驗(yàn)采用HPLC 法定量測定君藥淫羊藿所含淫羊藿苷、臣藥續(xù)斷所含川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以期為本品質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAG TLC SAMPLER 4 型自動(dòng)點(diǎn)樣儀，CAMAG REPROSTAR 3 型薄層成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）；Waters e2695 Sepatation Module 高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA 檢測器，四元梯度泵，Empower Pro 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；MilliPore Advantage A10 自動(dòng)純水機(jī)（美國MilliPore 公司）。

1.2 試藥

乙腈等HPLC 所用試劑均為色譜純（德國默克公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。

補(bǔ)肝益腎顆粒（批號(hào)：20181004、20181005、20181006）由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；淫羊藿對照藥材（批號(hào)：121632-201502）、白芍對照藥材（批號(hào)：120905-201610）、制何首烏對照藥材（批號(hào)：121454-201405）、淫羊藿苷對照品（批號(hào)：110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%）購自中國食品藥品檢定研究院；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號(hào)：C-014-170717，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿的鑒別取本品2 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，混合乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取淫羊藿對照藥材0.4 g，加水適量，加熱至沸騰并保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“用乙酸乙酯振搖提取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除淫羊藿外處方比例的其余7味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品2 g，自“加水20 mL 使溶解”起，同法制成淫羊藿陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗(yàn)，吸取上述溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H 薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（體積比13 ∶10 ∶10）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以AlCl3試液，105 ℃加熱2 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。 見圖1。

圖1 淫羊藿鑒別的薄層色譜圖Figure 1 TLC of Epimedii Folium

2.1.2 白芍的鑒別取本品4 g，研細(xì)，加乙醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和正丁醇溶液萃取2 次，每次20 mL，混合水飽和正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取白芍對照藥材1 g，加水適量，加熱至沸騰并保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“用水飽和正丁醇溶液萃取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除白芍外處方比例的其余7 味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品4 g，自“加乙醇25 mL”起，同法制成白芍陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗(yàn)，吸取供試品、對照藥材及陰性對照3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（體積比40 ∶5 ∶10 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%（質(zhì)量濃度）香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱約1 min。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。 見圖2。

圖2 白芍鑒別的薄層色譜圖Figure 2 TLC of Paeoniae Radix Alba

2.1.3 制何首烏的鑒別取本品4 g，加水30 mL 使溶解，用乙醚振搖提取2 次，每次30 mL，混合乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取制何首烏對照藥材1 g，加適量水煮沸30 min，濾過，濾液濃縮至約30 mL，自“用乙醚振搖提取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除制何首烏外處方比例的其余7 味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品4 g，自“加水30 mL 使溶解”起，同法制成制何首烏陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比10 ∶1 ∶1 ∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。 見圖3。

2.2 定量測定

2.2.1 對照品溶液的制備取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ254.75、113.75 μg 的混合對照品溶液，即得。

圖3 制何首烏鑒別的薄層色譜圖Figure 3 TLC of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

2.2.2 供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，精密稱取1 g，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流處理60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液的制備取甲醇溶液適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性研究色譜柱：phenomenex Luna Omega Polar C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）：0 ～20 min，25%A→30%A；20 ～30 min，30%A；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL／min；檢測波長：212 nm；進(jìn)樣量：10 μL。分別精密吸取對照品、供試品、空白溶液10 μL，按上述條件測定，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷計(jì)，不低于3 000；分離度＞1.5。 見圖4。

2.2.5 線性關(guān)系考察分別精密稱取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ10.19、4.55 mg，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，記編號(hào)MS1。 精密吸取MS1 5 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，記編號(hào)MS2；依次倍比稀釋制得MS3～MS6。 分別精密吸取上述6 種混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測定。 以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得到淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回歸方程分別為Y1＝1．998 5×105X1-7．369 4×104（r1＝0．999 9）、Y2＝1．791 5×105X2-5．836 2×103（r2＝0．999 9），線性范圍分別為：進(jìn)樣量0.318 4 ～10.190 0 μg、0.142 2 ～4.550 0 μg。 表明淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量與峰面積之間均具有良好的線性關(guān)系。

圖4 淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC 色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of icariin and asperosaponin Ⅵ

2.2.6 精密度試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法測定，連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 值分別為0.38%和0.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定。 計(jì)算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD值分別為0.88%和0.97%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為201801005 的補(bǔ)肝益腎顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法測定，平行操作6 份。 計(jì)算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.148 8%、0.193 6%，RSD 值分別為1.60%和1.72%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)取已知淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.149 4%、0.193 0%的補(bǔ)肝益腎顆粒（批號(hào)：201801005）9 份，每份0.5 g，精密稱定。 分別加入為樣品中待測成分約0.5、1.0、1.5倍量的淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。 結(jié)果淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均回收率分別為99.82%、100.70%，表明回收率良好。 見表1。

表1 補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery results of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝9）

2.2.10 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定分別取批號(hào)20181004、20181005、20181006 的補(bǔ)肝益腎顆粒各2 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 2 The contents of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝2） w／%

結(jié)果顯示，3 批補(bǔ)肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.154 3%和0.194 5%，以平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%設(shè)限，規(guī)定本品淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.124%，川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.156%。

3 討論

補(bǔ)肝益腎顆粒為水提制劑，因此進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定樣品前處理時(shí)考察了甲醇-水和乙醇-水溶媒體系，分別在甲醇、50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇、乙醇和50%乙醇4 種溶媒條件下測定淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明甲醇提取效果最佳。淫羊藿苷最大吸收波長為270 nm，而川續(xù)斷皂苷Ⅵ為212 nm，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在212 nm 下測定淫羊藿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與270 nm 下檢測時(shí)相比，結(jié)果區(qū)別不大，因此選取212 nm 作為測定波長同時(shí)測定2 種化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

本試驗(yàn)建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可快速、準(zhǔn)確反映該制劑質(zhì)量，為其臨床療效及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)，對補(bǔ)肝益腎顆粒的進(jìn)一步開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。