CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ 在前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后中的作用

凌濟(jì)忠張玉婷習(xí)明萬(wàn)頌華偉江敏耀萬(wàn)躍平

（1.廣州市花都區(qū)花山鎮(zhèn)衛(wèi)生院外科，廣東 廣州510880； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院南山班，廣東 廣州511436； 3.南方醫(yī)科大學(xué)花都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州510800）

前列腺癌是全球46 個(gè)國(guó)家男性癌癥死亡的主要原因［1］。 2019 年美國(guó)預(yù)計(jì)將新增174 650 例前列腺癌患者，位居男性癌癥發(fā)病率第1 位，同時(shí)預(yù)計(jì)新增31 620 例前列腺癌死亡患者，位居男性癌癥死亡率第2 位［2］。 為了防止過度診斷和過度治療，前列腺特異性抗原篩查在逐年減少，從而使前列腺癌發(fā)病率逐年下降，但是晚期診斷同時(shí)在逐年增加。 目前正面臨著缺乏在早期診斷中高危、致死性前列腺癌的手段，又能防止過度診斷和過度治療的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。 CCAAT ／增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ（CEBPD）是一種轉(zhuǎn)錄因子，涉及一系列的生理過程，如細(xì)胞分化、代謝、炎癥、生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞死亡［3］。 近年來，有許多研究表明CEBPD 與癌癥的進(jìn)展相關(guān)，如白血?。?］、肝細(xì)胞 癌［5］、乳 腺 腫 瘤［6］、尿 路 上 皮 癌 等［7］。 然 而，CEBPD 在前列腺癌中的表達(dá)情況及CEBPD 在前列腺癌進(jìn)展和預(yù)后方面的作用的報(bào)道較少。 本研究使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CEBPD 在前列腺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)合Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CEBPD 表達(dá)水平與患者臨床病理特征和生存期的關(guān)系，探討CEBPD在前列腺癌進(jìn)展和預(yù)后中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

前列腺癌及正常組織組微陣列芯片購(gòu)買自西安艾麗娜生物科技有限公司（Cat No：PR807a），包含正常組織3 例，邊緣組織7 例，腺癌組織50 例，增生組織20 例。 研究生存曲線的數(shù)據(jù)來源于Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)，包含150 例前列腺癌和29 例癌旁組織（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／query／acc.cgi？acc ＝GSE21032）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)： 按照邁新生物技術(shù)UltraSensitiveTMSP IHC 試劑盒（Cat. No：KIT-0305）說明進(jìn)行免疫組化染色，55 ℃烘烤組織芯片1 ，二甲苯、酒精梯度脫蠟，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，血清封閉，一抗CEBPD（1 ∶40；博奧森，Cat No：bs-13821R）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，三抗室溫孵育15 min，DAB 試劑盒顯色，蘇木素鹽酸復(fù)染細(xì)胞核。 芯片染色結(jié)果根據(jù)強(qiáng)度和范圍進(jìn)行評(píng)估，染色強(qiáng)度分為0、1、2、3 共4 個(gè)等級(jí)，染色范圍分為0（0 ～5%）、1（6% ～25%）、2（26% ～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）5 個(gè)等級(jí)，最終得分為染色強(qiáng)度與染色范圍之和。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 檢驗(yàn)，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織芯片中CEBPD 表達(dá)的檢測(cè)

在前列腺癌組織芯片中，利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CEBPD 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果可見前列腺癌組織中CEBPD 蛋白染色主要位于細(xì)胞質(zhì)中，染色強(qiáng)度為弱陽(yáng)性或陽(yáng)性。 染色強(qiáng)度定量分析結(jié)果顯示，正常前列腺組織和前列腺癌組織中CEBPD 染色評(píng)分分別為2.96±1.72 和3.70±1.40，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.056）（見表1）。 但是在前列腺癌患者中，Gleason 評(píng)分＜8 的癌組織中的CEBPD 染色評(píng)分高于Gleason 評(píng)分≥8 的癌組織（P＝0.032）（見圖1）。

圖1 前列腺癌組織芯片中CEBPD 的檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Detection results of CEBPD in prostate cancer tissue microarray

2.2 CEBPD 表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

通過前列癌組織芯片的臨床數(shù)據(jù)資料，探索CEBPD 蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示CEBPD 表達(dá)與Gleason 評(píng)分（P＜0.032）相關(guān)，同時(shí)結(jié)合Taylor 公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)CEBPD 表達(dá)與患者的年齡（P＝0.041）、Gleason 評(píng)分（P＜0.01）、臨床分期（P＝0.018）、是否轉(zhuǎn)移（P＜0.01）、是否死亡（P＝0.029）、是否生化復(fù)發(fā)（P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)（見表1）。

表1 前列腺癌患者CS 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between CS expression and clinicopathological features of prostate cancer patients

2.3 CEBPD 在Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)中的生存曲線統(tǒng)計(jì)

通過Taylor 公共數(shù)據(jù)庫(kù)探索CEBPD 的表達(dá)與前列腺癌病人的生存期的關(guān)系，以CEBPD基因表達(dá)量的中位數(shù)為界線分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，CEBPD 低表達(dá)病人的無生化復(fù)發(fā)生存率比CEBPD高表達(dá)病人的生存率低（P＜0.01），總體生存率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.227）（見圖2）。

2.4 CEBPD 在Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)中的COX 回歸分析統(tǒng)計(jì)

基于CEBPD 在Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)中的無生化復(fù)發(fā)生存曲線有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立COX回歸模型，分析單因素和多因素的條件下，CEBPD與無生化復(fù)發(fā)生存率的相關(guān)性。 結(jié)果顯示，在單因素分析和多因素COX 回歸生存分析中，CEBPD 高表達(dá)與前列腺癌患者的生化復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)（單因素：P＜0．01；多因素：P＝0.032）（見表2）。

圖2 Taylor 數(shù)據(jù)庫(kù)中CEBPD 的生存曲線分析Figure 2 Survival curve of CEBPD in Taylor database

表2 前列腺癌患者的無生化復(fù)發(fā)COX 回歸分析與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship between non-BCR COX regression and clinicopathological features in patients with prostate cancer

3 討論

CEBPD 屬于CCAAT ／增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族，與其余4 個(gè)家族成員一起作為轉(zhuǎn)錄因子起調(diào)節(jié)細(xì)胞生物過程的作用，包括細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)停滯、增殖和死亡。 CEBPD 在正常生理?xiàng)l件下以相對(duì)低的水平表達(dá)，并且被多種細(xì)胞外刺激上調(diào)，例如白細(xì)胞介素-6，脂多糖，白細(xì)胞介素-1β，腫瘤壞死因子α，干擾素-α和干擾素-γ。 CEBPD 的過表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡［5］。 此外，在Cebpd-／-／HER2／neu小鼠中觀察到乳腺腫瘤多樣性的增加［6］。 這些結(jié)果表明CEBPD 可能是腫瘤抑制因子。 與炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和STAT3 不同，它們?cè)谀[瘤發(fā)生后一直被激活，CEBPD 的失活已經(jīng)在許多癌癥中被觀察 到，包 括 肝 癌，乳 腺 癌 和 白 血 病［5，8-10］。 但 是CEBPD 作為抑癌基因的作用并不普遍，對(duì)于尿路上皮癌CEBPD 拷貝數(shù)擴(kuò)增和過表達(dá)可能與預(yù)后不良和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)［11］。 基于上述看似矛盾的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)腫瘤的類型或者細(xì)胞的來源，CEBPD可能與更好或更差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)，但要證實(shí)其在特定類型癌癥中的真正作用還需要進(jìn)一步的研究。

本研究通過免疫組化染色前列腺癌組織芯片發(fā)現(xiàn)，在該芯片中CEBPD 在前列腺良性組織和前列腺癌組織中的表達(dá)沒有顯著差異，有可能是因?yàn)榱夹越M織例數(shù)過少，存在抽樣誤差。 但是在前列腺癌患者中，Gleason 評(píng)分＜8 的癌組織中的CEBPD 表達(dá)水平高于Gleason 評(píng)分≥8 的癌組織，說明在前列腺癌中CEBPD 可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。 其次，在Taylor 公共數(shù)據(jù)庫(kù)的分析中，發(fā)現(xiàn)CEBPD 表達(dá)與患者的年齡、Gleason 評(píng)分、臨床分期、是否轉(zhuǎn)移、是否死亡、是否生化復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)CEBPD 高表達(dá)的前列腺癌患者的無生化復(fù)發(fā)生存率增高。 結(jié)合COX 回歸模型，單因素分析提示提示CEBPD、病理分期、Gleason 評(píng)分和是否轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率的預(yù)后因子，而進(jìn)一步的多因素分析則提示CEBPD、病理分期和是否轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立預(yù)后因子，CEBPD 表達(dá)高的患者生化復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較小。 上述結(jié)果說明，CEBPD 的表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。

本研究結(jié)果提示CEBPD 表達(dá)可能對(duì)前列腺癌的臨床預(yù)后有預(yù)測(cè)作用，可以通過檢測(cè)CEBPD 表達(dá)水平，聯(lián)合PSA 檢測(cè)、Gleason 評(píng)分、病理分期等其他臨床技術(shù)，更好地分析和評(píng)估癌癥進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，有希望成為一種新的生物標(biāo)記物。 同時(shí)，CEBPD 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生物運(yùn)動(dòng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，CEBPD如何在人前列腺癌中發(fā)揮抑癌因子的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。