輻射表達載體Egr1-survivin shRNA聯(lián)合放療對食管鱗癌ECA109細胞放療敏感性的影響

王海峰，阿曼姑麗·艾合買提，陸艷榮，呂 茵，張瑾熔

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2018年全球食管癌新發(fā)病例57.20萬例，占全球惡性腫瘤發(fā)病率第7位；死亡病例50.86萬例，占全球惡性腫瘤死亡率第6位[1]。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，2015年我國食管癌新發(fā)24.6萬例，死亡18.8萬例，分別占惡性腫瘤發(fā)病及死亡率的第6位及第4位[2]，我國的食管癌的新發(fā)病例數(shù)及死亡人數(shù)幾乎占世界的一半。放射治療是不能手術(shù)的中晚期食管癌最主要的治療手段[3]，但放射治療的效果并不令人滿意。張安度等[4]報道，盡管采用三維適形放療技術(shù)，食管癌放療的5年生存率也只有24.5%?？籽愕萚5]發(fā)現(xiàn)，局部未控或復(fù)發(fā)仍然是放療失敗的首要原因。

survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proreins，IAPs)家族最小的成員，其可與多種內(nèi)源性及外源性途徑的凋亡調(diào)控因子相互作用，明顯地抑制凋亡的發(fā)生[6]，是食管癌細胞放射抵抗的重要原因之一，可作為增加食管鱗癌放療敏感性的治療靶點[7, 8]。Egr1基因?qū)儆诩纯淘缙诨蚣易?immediate early genes，IEGs)的成員，其啟動子含有輻射感應(yīng)組件，使其能被放射線所誘導(dǎo)而表達增高。有學(xué)者提出了將Egr1基因的啟動子序列與需要表達的基因序列連接，用電離輻射驅(qū)動Egr1基因的啟動子帶動目的基因高表達的基因-放射治療理論。其研究結(jié)果表明，電離輻射可明顯誘導(dǎo)重組質(zhì)粒中位于Egr1啟動子下游的目的基因表達增強，其抑瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于單純放療和單純基因治療[9, 10]。基于以上研究，本研究以survivin作為治療靶點，利用Egr1基因啟動子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞，來證實此種方法是否會進一步促進食管癌細胞凋亡，增加食管癌細胞的放射敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：ECA109細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司合成。細胞培養(yǎng)于RPMI-1640+10%胎牛血清+1%雙抗中。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)，Trizol(Aidlab)，HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、50×ROX Reference Dye 2、SYBR Green Master Mix(VAZYME)，Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物)，兔多抗survivin(武漢三鷹生物)，HRP標記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物)，ECL底物液(Thermo)，X光膠片(柯達)，顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)，細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒(三箭生物)。

1.2 細胞分組處理 食管癌ECA109細胞按照處理方式分為：(1)空白對照組，不加任何處理+放療；(2)空載體對照組，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒+放療；(3)Egr1-survivin shRNA組，轉(zhuǎn)染pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒+放療；(4)YM155組，YM155處理+放療。每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作步驟依照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。測定食管癌ECA109細胞YM155的IC50值為5 nM。向加入細胞培養(yǎng)后的6孔板加入YM155溶液，調(diào)節(jié)YM155的終濃度5 nM。轉(zhuǎn)染及YM155處理48 h后進行細胞照射，照射方法為：6 MV-X 射線進行室溫垂直照射，劑量率200 cGy/min，10 cm×10 cm照射野，100 cm源皮距，照射劑量單次4 Gy，照射后24 h收獲細胞進行各項檢測。

1.3 qPCR檢測各處理組ECA109細胞survivin mRNA水平 利用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA的純度和濃度后，取1 μg按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。合成的cDNA做10倍稀釋，進行qPCR檢測。qPCR反應(yīng)體系：cDNA4 μl，F(xiàn)orward Primer (10 μM) 0.4 μl，Reverse Primer (10 μM)0.4 μl，SYBR Green Master Mix10 μl，50×ROX Reference Dye20.4 μl，ddH2O 4.8 μl；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec ，60 ℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進行分析。survivin引物序列：F: 5′-CCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCT-3′，R: 5′-CTCGTTCTCAGTGGGGCAGTGGATG-3′。GAPDH引物序列：F: 5′-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3′，R: 5′-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3′。

1.4 Western-Blot檢測各處理組ECA109細胞survivin蛋白水平 向按分組處理好的細胞加入RIPA裂解液，于冰上充分裂解后收集上清至預(yù)冷EP管中，于4 ℃下12 000 r/min離心5 min。取上清用BCA法測定蛋白濃度。后將提取的蛋白充分變性，調(diào)整每個樣品蛋白上樣量為40 μg，進行SPS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后在0 ℃恒流條件下電轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：survivin 200 mA 50 min，GAPDH 200 mA 90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉、洗膜后，進行抗體雜交，經(jīng)一抗、二抗孵育后X光顯影，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值進行分析。

1.5 流式細胞儀檢測各處理組細胞周期和凋亡 將按不同分組處理后細胞于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化細胞，1200 r/min，5 min離心，分別收集各處理組細胞。細胞周期檢測：加PBS洗滌一次，加入100 μl PBS重懸細胞后，緩慢加入700 μl預(yù)冷的80%乙醇，4 ℃固定4 h以上，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入400 μl PI(50 μg/ml)，4 ℃避光染色30 min，后用流式細胞儀檢測細胞周期。細胞凋亡檢測：加PBS洗滌2次，按照APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行：(1)加入500 μl Binding Buffer，重懸細胞；(2)5 μl 7-AAD混勻后加入5 μl APC，混勻；(3)室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 各處理組ECA109細胞survivin mRNA及蛋白的表達結(jié)果 從表1、圖1的qPCR及Western-Blot檢測結(jié)果可見，Egr1-survivin shRNA+放療組ECA109細胞survivin mRNA及蛋白的相對表達量明顯低于單純放療的空白對照組和空載體對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；mRNA水平Egr1-survivin shRNA組低于YM155+放療組(P<0.01)，但在蛋白水平其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.102)。YM155+放療組survivin mRNA及蛋白的相對表達量也明顯低于空白對照組和空載體對照組(P<0.01)。

組別survivin mRNAsurvivin蛋白空白對照組1.050±0.109①0.838±0.035①空載體對照組1.026±0.169①0.869±0.059①Egr1-survivin shRNA組0.497±0.1120.447±0.064YM155組0.747±0.092①0.544±0.088

注：與Egr1-survivin shRNA組比較, ①P<0.01

圖1 食管鱗癌ECA109細胞各處理組 survivin 蛋白表達結(jié)果

1.空白對照組; 2.空載體對照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

2.2 流式細胞儀檢測ECA109細胞各處理組細胞周期的結(jié)果 從表2、圖2細胞周期檢測結(jié)果可見，經(jīng)Egr1-survivin shRNA+放療及YM155+放療處理后，ECA109細胞的細胞周期分布發(fā)生明顯變化，G2期與S期細胞比例明顯增加。Egr1-survivin shRNA組G2，S期細胞比例明顯高于空白對照組和空載體對照組，Egr1-survivin shRNA組與這兩組的G2，S期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Egr1-survivin shRNA組與YM155組相比，G2期Egr1-survivin shRNA組高于YM155組，S期低于YM155組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

組別G1G2S空白對照組83.02±1.345.22±0.17①11.76±1.26①空載體對照組82.51±0.146.01±0.42①11.47±0.30①Egr1-survivin shRNA組55.24±0.5819.07±0.4025.69±0.19YM155組50.68±0.2513.10±0.43①36.22±0.29①

注：與Egr1-survivin shRNA組相比,①P<0.01

2.3 流式細胞儀檢測 ECA109細胞各處理組凋亡的結(jié)果 ECA109細胞凋亡百分率：空白對照組1.56±0.59；空載體對照組1.91±0.30；Egr1-survivin shRNA組15.39±0.49；YM155組11.55±1.31。Egr1-survivin shRNA組及YM155組凋亡率均明顯高于空白對照組和空載體對照組，Egr1-survivin shRNA組與YM155組相比凋亡率也明顯增高，Egr1-survivin shRNA組與其他三組的細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，(P<0.01)。經(jīng)Egr1-survivin shRNA+放療及YM155+放療處理后，ECA109細胞的凋亡明顯增加(圖3)。

圖2 食管鱗癌ECA109細胞各處理組細胞周期檢測結(jié)果

1.空白對照組; 2.空載體對照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

圖3 食管鱗癌ECA109細胞各處理組凋亡檢測結(jié)果

1.空白對照組; 2.空載體對照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

3 討 論

食管癌是我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤，放療是頸段及局部進展期胸段食管癌的主要根治手段，但放療的療效并不令人滿意。張安度等[4]對1349例食管癌進行的三維適形放療療效分析，全組患者1、3、5年局控率分別為75.2%、54.5%、50.1%；1、3、5 年生存率分別為68.6%、36.2%、24.5%，中位生存期21個月。說明雖然隨著放療技術(shù)進入三維時代，食管癌放療療效仍有待于進一步提高。即便是近期完成的NEOCRTEC5010研究，其結(jié)果顯示對于潛在可切除的胸段食管鱗癌，術(shù)前同步放化療組的pCR率為43.2%，OS為100.1個月，較以前的治療模式有明顯提高[11]，但與其他常見惡性腫瘤的療效相比，食管癌放療的生存期仍不能令人滿意，急需探索新的治療靶點和治療理念。

survivin蛋白與食管癌的發(fā)生及進展密切相關(guān)，Dabrowski等[12]研究顯示，survivin在食管鱗癌標本中表達明顯升高，其陽性率可達83.33%，而且文獻[7]顯示其過表達與患者較差的預(yù)后相關(guān)。Egr1基因啟動子區(qū)含有CArG盒/CC(A+T-rich)GG區(qū)的特殊結(jié)構(gòu)，使Egr1基因能被放射線所誘導(dǎo)而表達增高。利用這一特點，我們以survivin作為治療的靶點，利用可被電離輻射誘導(dǎo)的Egr1基因啟動子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管鱗癌ECA109細胞后用X射線照射，測定細胞內(nèi)survivin的mRNA表達和蛋白水平的變化情況，并觀察Egr1-survivin shRNA下調(diào)survivin基因后對ECA109細胞周期及凋亡的影響，以確定這種干預(yù)否會進一步增加食管癌細胞的放射敏感性，促進食管癌細胞死亡。

本研究結(jié)果顯示，Egr1-survivin shRNA+放療處理后，ECA109細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平均較對照組明顯下調(diào)，證實Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒合成是成功的，經(jīng)X射線照射誘導(dǎo)，Egr1啟動子確實帶動了位于其下游合成質(zhì)粒中的survivin shRNA表達增加，并進而降低了survivin mRNA及蛋白的表達，與文獻[8]報道的通過survivin-shRNA轉(zhuǎn)染可下調(diào)survivin的表達相一致。用以做陽性對照的是YM155+放療處理，YM155是一種靶向survivin的小分子藥物，其可與survivin基因的啟動子區(qū)結(jié)合，從而選擇性地抑制其表達[13]。文獻[14]報道其可通過降低survivin表達而發(fā)揮放療增敏作用，本研究也顯示YM155+放療處理后，ECA109細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平較空白對照組及空載體組均明顯下調(diào)，證實其所具有survivin基因的表達抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Egr1-survivin shRNA+放療處理后，ECA109細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平均較三個對照組下調(diào)。伴隨著survivin表達下調(diào)，G2期與S期細胞比例明顯增加，發(fā)生了明顯的G2期與S期阻滯，且細胞凋亡率明顯增高，表明Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染+放療可明顯增加食管癌細胞的放射敏感性。本研究與文獻[10, 15-17 ]報道的結(jié)論類似，利用Egr1基因啟動子，通過輻射誘導(dǎo)，帶動不同的靶基因表達上調(diào)，其抑瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于單純放療和單純基因治療。

本研究結(jié)果顯示，Egr1-survivin shRNA+放療對于survivin表達的抑制在所有處理組中是最強的，相較于單純放療、YM155處理+放療，可更大程度地降低survivin的表達。且經(jīng)Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染降低survivin后聯(lián)合放療，其促凋亡作用也強于YM155+放療處理，證實此種方法相比于YM155處理，對于食管鱗癌細胞具有更強的放射增敏作用。由此可得出：Egr1-survivin shRNA聯(lián)合放療可進一步增加食管鱗癌細胞放療敏感性，是一種有前景的食管癌治療基因-放療思路，有進一步研究價值。因本實驗為細胞學(xué)研究，其得出的結(jié)論還有待于動物實驗及人體的臨床試驗進一步證實。