小果唐松草的化學(xué)成分及抑菌活性研究

蔣 捷，程 璐，馬浩然，靳小琪，王富乾

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部(湖北 武漢 430022)

小果唐松草(ThalictrummicrogynumLecoy.ex Oliv)俗稱(chēng)“飛蛾七”，是毛茛科(Ranunculaceae Juss)唐松草屬(ThalictrumL.)的多年生草本植物，主要分布于我國(guó)的云南、山西、湖北、湖南等地[1]，具有抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)、抗血小板聚集、抗病毒、抗炎、抑菌等作用[2]，長(zhǎng)期作為民族藥用于治療退熱解表、跌打損傷、全身黃腫、眼睛發(fā)黃、祛寒等[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)小果唐松草的化學(xué)成分研究極少，僅1篇文獻(xiàn)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究[1]。因此，為了補(bǔ)充其化學(xué)成分及藥理活性研究的空缺，找到該植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效成分，本研究對(duì)小果唐松草的根莖進(jìn)行了化學(xué)成分及抑菌活性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器Waters(2535/2998)半制備液相(美國(guó)Waters)，Waters SunFire TM半制備色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm)，Bruker AM-400和Bruker Avance 600型核磁共振儀(德國(guó)Bruker)，AB SCIEX API 4000質(zhì)譜儀RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)艾卡)，EZ Plus中壓色譜儀(利穗科技)，ZF-7型三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，硅膠G254薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)，Sephadex TM LH-20凝膠(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，色譜甲醇，色譜乙腈(Tedia)，提取用95%工業(yè)乙醇，其余試劑均為分析純。

1.2植物來(lái)源與鑒定小果唐松草產(chǎn)于湖北神農(nóng)架林區(qū)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院張長(zhǎng)弓教授鑒定為毛茛科唐松草屬的草本植物小果唐松草。

2 提取與分離

將小果唐松草的根莖1.0 kg打粉后，室溫下經(jīng)95%乙醇浸泡提取3次，3 d/次，取提取液真空濃縮后，將所得浸膏用3 L蒸餾水混懸，置于分液漏斗中，用乙酸乙酯溶液進(jìn)行多次萃取，旋干后得乙酸乙酯部位28.734 g。取乙酸乙酯部分在(200～300目)硅膠柱上進(jìn)行分離，洗脫劑采用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(30∶1→1∶1)，二氯甲烷-甲醇(20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1)梯度洗脫，得到11個(gè)組分Fr.1-Fr.11。

Fr.4經(jīng)正相硅膠柱，石油醚-醋酸乙酯(10∶1→1∶1)洗脫得到Fr.4.1-Fr.4.7，F(xiàn)r.4.3經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到Fr.4.3.1-Fr.4.3.5，F(xiàn)r.4.3.1經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)，分離得到Fr.4.3.1.1，F(xiàn)r.4.3.1.2，F(xiàn)r.4.3.1.2經(jīng)反向中壓色譜及制備HPLC后得化合物1(洗脫條件65%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間25 min，5.87 mg)。Fr.4.3.4經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)，分離得到Fr.4.3.4.1-Fr.4.3.4.4，F(xiàn)r.4.3.4.2經(jīng)半制備HPLC得化合物2(洗脫條件65%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間21 min，7.97 mg)。Fr.4.2經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到Fr.4.2.1-Fr.4.2.5，其中4.2.3經(jīng)半制備HPLC得到化合物3(洗脫條件62%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間16 min，9.12 mg)。Fr.5經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到Fr.5.1-Fr.5.7，F(xiàn)r.5.4經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到Fr.5.4.1-Fr.5.4.4,，其中Fr.5.4.4經(jīng)半制備HPLC得到化合物4(洗脫條件60%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間19 min，7.83 mg)。Fr.5.1經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離后得Fr.5.1.1-Fr.5.1.4，F(xiàn)r.5.1.2經(jīng)反相中壓色譜后經(jīng)半制備HPLC得化合物5(洗脫條件55%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間23 min，9.40 mg)。Fr.10經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到Fr.10.1-Fr.10.3，F(xiàn)r.10.2經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫得到Fr.10.2.1-Fr.10.2.6，其中Fr.10.2.5重結(jié)晶得化合物6(甲醇中析出，9.00 mg)。Fr.8經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)洗脫得到Fr.8.1-Fr.8.4，F(xiàn)r.8.1經(jīng)反相中壓色譜后得Fr.8.1.1-Fr.8.1.4，F(xiàn)r.8.1.1經(jīng)半制備HPLC得化合物7(洗脫條件35%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間20 min，8.43 mg)。Fr.9經(jīng)正相硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(20:1→1:1)洗脫得到Fr.9.1-Fr.9.8，F(xiàn)r.9.6經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)和SephadexLH-20凝膠柱色譜(甲醇)洗脫后得到Fr.9.6.1-Fr.9.6.7，F(xiàn)r.9.6.7經(jīng)半制備HPLC得到化合物8(洗脫條件15%乙腈等度洗脫，保留時(shí)間24 min，8.03 mg)。

表1 化合物1-8的分離流程

續(xù)表1：

化合物分離流程化合物7Fr.8凝膠(二氯甲烷-甲醇1∶1)→Fr.8.1.1HPLC(35%乙腈等度洗脫)→化合物7(8.43mg)化合物8Fr.9正相(二氯甲烷-甲醇20∶1→1∶1)→Fr.9.6凝膠(二氯甲烷-甲醇1∶1)→Fr.9.6.7HPLC(15%乙腈等度洗脫)→化合物8(8.03mg)

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：綠色油狀固體(二氯甲烷)，ESI-MSm/z:279[M+H]+。經(jīng)比較化合物1的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]中報(bào)道基本一致，鑒定化合物1為n-butyl-isobutyl terephthalate，見(jiàn)表2。

表2 化合物1的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物2：無(wú)色柱狀結(jié)晶(二氯甲烷)，mp 136～137℃，ESI-MS m/z:235[M+H]+，經(jīng)比較化合物2的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，鑒定化合物2為纈草烯酸，見(jiàn)表3。

表3 化合物2的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物3：白色粉末(二氯甲烷)，mp 218～219℃，ESI-MS m/z:468 [M+H]+，經(jīng)比較化合物3的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，鑒定化合物 3為乙酸蛇麻脂醇酯，見(jiàn)表4。

化合物4：黃色油狀液體(二氯甲烷)，ESI-MS m/z:208 [M+H]+，經(jīng)比較化合物4的波譜數(shù)據(jù)與與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，鑒定化合物 4為9,10-anthracenediones，見(jiàn)表5。

表4 化合物3的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

表5 化合物4的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物5：無(wú)色粉末(二氯甲烷)，mp 57-59℃，ESI-MS m/z:427 [M+H]+，經(jīng)比較化合物5的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，鑒定化合物5為stigmast-4-ene-3,6-dione，見(jiàn)表6。

表6 化合物5的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

續(xù)表6：

positionδCδHpositionδCδH834.31.90m2326.1—951.0—2445.9—1039.8—2529.21.66m1120.91.63,1.4 m2619.00.81d(6.5)1239.22.13,1.91m2719.80.83t(6.5)1342.6—2823.1—1456.6—2912.00.85t(7.0)1524.01.62m

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物6：無(wú)色片狀晶體(二氯甲烷)，mp 170～172℃，ESI-MS m/z:413[M+H]+，經(jīng)比較化合物6的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，鑒定化合物6為豆甾醇，見(jiàn)表7。

表7 化合物6的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物7：黃色油狀固體(二氯甲烷)，mp 250～251 ℃，ESI-MS m/z:169[M+H]+，經(jīng)比較化合物7的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，鑒定化合物7為2,6-二甲氧基苯醌，見(jiàn)表8。

表8 化合物7的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

化合物8：黃色油狀固體(甲醇)，ESI-MS m/z:126[M+H]+，經(jīng)比較化合物8的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，鑒定化合物8為5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carboxaldehyde，見(jiàn)表9。

表9 化合物8的碳譜(101 MHz)、氫譜(400 MHz)數(shù)據(jù)

注：—：表示該處無(wú)信號(hào)。

4 化合物抑菌活性評(píng)價(jià)

采用微量倍比稀釋法測(cè)定，測(cè)定化合物1～8對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。將化合物1-8用甲醇溶解后稀釋為200 μg/mL作為受試藥物。取無(wú)菌96 孔平底微量培養(yǎng)板，用移液槍每孔加入培養(yǎng)液100 μL;然后在第1行每孔依次加入受試藥物100 μL，混勻后取出100 μL 移至第2 行中，依次進(jìn)行倍比稀釋直至第8 行混勻后棄掉100 μL，使稀釋后各孔中的受試藥物濃度倍比降低，最后每孔中加入106CFU·mL-1稀釋菌懸液后于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示：化合物2對(duì)綠膿假單胞菌MIC為100 μg/mL，對(duì)大腸桿菌MIC為50 μg/mL，化合物8對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為50 μg/mL。

5 討論

小果唐松草是我國(guó)常用的民族藥材，雖然民族藥的使用有其獨(dú)特性，卻缺乏系統(tǒng)、科學(xué)的資源評(píng)價(jià)模式，多數(shù)民族藥沒(méi)有確定的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，因此導(dǎo)致藥物的濫用及藥物中的有毒成分對(duì)人體造成傷害，因此，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分研究，尋找該植物中的有效化學(xué)成分，確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)其合理用藥提供依據(jù)。本研究通過(guò)對(duì)其根莖提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行了分離，得到了8個(gè)化合物，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物2對(duì)綠膿假單胞菌MIC為100 μg/mL，對(duì)大腸桿菌MIC為50 μg/mL，化合物8對(duì)金黃色葡萄球菌MIC為50 μg/mL，本實(shí)驗(yàn)為小果唐松草的后續(xù)深入研究提供了一定的基礎(chǔ)。