核桃內(nèi)生真菌抗氧化菌株的篩選及其代謝產(chǎn)物活性研究

龐俊倩，趙鑫丹，郝苑汝，高 飛，翟梅枝

西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院核桃研究中心，楊凌 712100

由于食品、醫(yī)藥等工業(yè)的需求，從自然界中尋找天然的、安全的抗氧化劑受到越來越多的關(guān)注，植物資源是目前天然抗氧化劑的主要來源。內(nèi)生真菌是生活在植物組織內(nèi)，但不對宿主造成明顯病害癥狀的腐生、寄生、共生真菌及細(xì)菌等微生物[1]。有研究表明，內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織當(dāng)中，它們能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì),許多活性成分被證明具有明顯的抗癌、抗菌、抗氧化等活性[2]，是獲得抗菌、抗氧化藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。植物內(nèi)生菌中得到的天然抗氧化劑結(jié)構(gòu)新穎，活性顯著，為天然抗氧化活性物質(zhì)提供了又一豐富的資源。

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬落葉喬木，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，資源豐富[3]。核桃各組織本身具有抗氧化活性，Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取物不同溶劑的提取相具有不同程度的抗氧化作用，Wei等[5]研究了核桃葉提取物及其各萃取部分的抗氧化活性，結(jié)果表明核桃葉75%乙醇提取物對DPPH·及ABTS+·IC50均低于VC。這些研究表明，核桃不同組織提取物具有較高的抗氧化活性。根據(jù)宿主共生理論，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化合物，在核桃內(nèi)生真菌中是否同樣存在高活性抗氧化物質(zhì)亟待研究。目前，對于核桃內(nèi)生真菌的研究多集中在多樣性和抗菌方面方面[6,7]，對抗氧化活性的研究報道較少，本研究以期為核桃內(nèi)生真菌高抗氧化菌株作為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

供試29株核桃內(nèi)生真菌，均由本實(shí)驗室從宜君、藍(lán)田兩地采集不同核桃組織中分離得到，經(jīng)純化后現(xiàn)保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃研究中心實(shí)驗室。菌種編號、分離部位、采樣季節(jié)以及菌株歸屬見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)，用于內(nèi)生真菌的活化培養(yǎng)；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)，用于內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：VC(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；沒食子酸(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；二苯代苦味肼基自由基(DPPH·，純度>97%，東京化成工業(yè)株式會社)；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；試劑均為分析純。

主要儀器：UV-1200 紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；SKY-2102C型恒溫震蕩培養(yǎng)箱(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將4 ℃保存的內(nèi)生真菌接種于PDA平面固體培養(yǎng)基上，在28±1 ℃下培養(yǎng)4～6天，待菌落長至直徑40～50 mm，保存用于液體發(fā)酵。

1.2.2 內(nèi)生真菌的發(fā)酵

在無菌條件下用直徑為6 mm的打孔器在活化好的內(nèi)生真菌菌落外緣打取菌餅，用接種針接種至含300 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基500 mL錐形瓶中，在28±1 ℃、180 rpm搖床上震蕩培養(yǎng)7天。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物及不同溶劑抗氧化樣液的制備

發(fā)酵產(chǎn)物樣品液制備：發(fā)酵液經(jīng)雙層濾紙過濾，在60～65 ℃、70 rpm的條件下，減壓濃縮至浸膏狀，配成1 mg/mL的樣品溶液，備用。

高活性菌株萃取液制備：高活性菌株大量發(fā)酵(方法同1.2.2)，發(fā)酵液減壓濃縮至原體積的1/10，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每種溶劑萃取三次，減壓濃縮成浸膏狀，依次得到石油醚提取物(PEE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、正丁醇提取物(BAE)及萃余物(WTE)，備用。

1.2.4 DPPH·自由基清除率測定

參照Tan等[8]的方法稍作修改，取2 mL DPPH·(0.1 mmol/L)乙醇溶液，加入2 mL 1 mg/mL樣品溶液，搖勻，室溫避光下靜置30 min，在波長517 nm處測定吸光值。試驗設(shè)置3組平行，結(jié)果取平均值，并以VC為陽性對照。

1.2.5 總還原力測定

總還原力采用FRAP法，TPTZ工作液配制參考Kaushik等[9]的方法。用VC作標(biāo)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Vc

1.2.6 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量測定釆用福林酚法，參照Rosana等[10]的方法。用沒食子酸作標(biāo)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2(a)。黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[11]，用蘆丁作標(biāo)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2(b)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性菌株的篩選

2.1.1 供試29株核桃內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·的清除作用

29株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·清除率結(jié)果見表1。

圖2 沒食子酸(a)、蘆丁(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid(a) and rutin(b)

表1 29株核桃內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·清除率

續(xù)表1(Continued Tab.1)

編號Strain No.季節(jié)Season組織Part (tissue) of the plant屬GenusDPPH·清除率DPPH· scavenging rate(%)LTL-6-6夏Summer交鏈孢霉屬Alternaria11.63±2.01LTS-6-6夏Summer須殼孢屬Pyrenochaeta96.47±0.99LTS-6-4夏Summer黑蔥花霉屬Periconia44.38±0.01LTS-6-1夏Summer交鏈孢霉屬Alternaria52.60±1.58LTL-6-5夏Summer小卵孢霉屬Ovularia26.36±0.88

注：供試濃度：1 mg/mL。

Note:Test concentration:1 mg/mL.

由表1可見，供試29株核桃內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物均具有一定的抗氧化活性，但抗氧化活性各不相同。在供試濃度1 mg/mL時，樣品LTS-6-6抗氧化活性能力最強(qiáng)，對DPPH·自由基的清除率為96.47%±0.99%；樣品YJL-3-5、YJL-5-3、YJL-2-4、LTS-3-1、YJL-2-5、LTL-3-1、LTL-5-4和LTS-6-1也顯示了較強(qiáng)的抗氧能力，對DPPH·的清除率均超過50%，其他20個樣品對DPPH·清除率都小于50%，尤其菌株LTS-2-1、LTL-2-2、YJS-5-2的發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力最弱，DPPH·清除率都小于10%。鑒于此，將對DPPH·清除率超過50%的9株真菌作為活性菌株，進(jìn)一步考察它們的總還原力。

9株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·清除率大于50%的活性菌株。測試樣品對DPPH·呈現(xiàn)出了不同程度的清除作用，從分離部位看，一年生莖2株、兩年生莖3株、葉2株和果2株。由此可看出，活性菌株主要來自于當(dāng)年生或兩年生組織中。從歸屬來看，5株屬于花核菌屬，即：YJL-2-4、YJL-2-5、YJL-3-5、LTL-3-1、LTS-3-1。在濃度為1 mg/mL時，這5株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·清除率在56.33%～77.16%；2株歸屬為交鏈孢霉屬，清除率在52.60%～56.84%；另外1株來自于派倫霉屬，清除率78.28%；一株來自于須殼孢屬，清除率為96.47%。從分離地點(diǎn)看，來自宜君的4株，來自藍(lán)田的5株。綜合分析認(rèn)為，核桃內(nèi)生真菌中花核菌屬、交鏈孢霉屬與其他菌屬相比，發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗氧化活性。

2.1.2 較強(qiáng)活性菌株總還原力比較

抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系。亞鐵還原能力測定是評價物質(zhì)抗氧化能力的一種通用的方法，通常物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力就越強(qiáng)[12]。對9株DPPH·清除率超過

50%的菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行總還原力測定。結(jié)果如圖3所示。

圖3 活性菌株的總還原力 Fig.3 The total antioxidant capacity of 9 active strains of better DPPH· radical注：A，B，C，D代表顯著性差異，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences compared with each other,P<0.01.

由圖3可見，供試9株活性菌株的總還原力依次為：LTS-6-6>YJL-5-3>LTL-3-1>YJL-2-5>LTL-5-4>YJL-3-5>LTS-6-1>LTS-3-1>YJL-2-4。其中，菌株LTS-6-6的總還原力為130.47 mg VC/g，顯著高于其他菌株；其余8株內(nèi)生真菌的總還原力均在15 mg VC/g以下，總還原力最低的是YJL-2-4，僅為9.54 mg VC/g。故選擇LTS-6-6作為抗氧化高活性菌株進(jìn)行下一步研究。

2.2 高活性菌株LTS-6-6不同部位萃取物的抗氧化活性評價

2.2.1 高活性菌株LTS-6-6不同萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力

對高活性菌株LTS-6-6各萃取物的總還原力和總酚、總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表2和圖4所示。

表2 LTS-6-6不同部位萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力

注：A、B、C、D代表顯著性差異，同一指標(biāo)相互比較，P<0.01。

Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

圖4 LTS-6-6不同部位萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力Fig.4 Total phenol content,total flavonoid and total antioxidant capacity of different extracts from LTS-6-6注：A，B，C，D代表顯著性差異，同一指標(biāo)相互比較，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

由表2和圖4可知，就總還原力而言，EAE的總還原力最高，為527.59±10.66 mg VC/g，顯著高于其它溶劑提取物；BAE總還原力居中，為149.08±3.62 mg VC/g；WTE和PEE總還原力最低，分別為60.60±1.28和66.48±0.21 mg VC/g，僅為EAE的1/9、1/8。就總酚含量而言，EAE的含量最高，為641.14±7.50 mg 沒食子酸/g；WTE總酚含量最低，為38.91±0.54 mg 沒食子酸/g。不同溶劑提取物總酚含量之間差異顯著，EAE的總酚含量分別為PEE、BAE、WTE的4倍、7倍、16倍。就總黃酮而言，EAE的總黃酮含量最高，為100.30±8.44 mg/g，分別為PEE、BAE、WTE的3倍、6倍、9倍。

眾多研究[13,14]表明，黃酮類和多酚類物質(zhì)是天然抗氧化劑的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。在對高活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的各萃取物總酚、總黃酮、總還原力測定的基礎(chǔ)上，分析總酚、總黃酮含量和總還原力的相關(guān)性，總還原力與總酚、總黃酮含量呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.8771、0.9177。萃取后，乙酸乙酯部分多酚和黃酮類物質(zhì)得到富集，含量最高。不同萃取物中的總還原力和總酚含量之間呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，即總酚和總黃酮含量高的萃取相，總還原力也強(qiáng)。由此推斷，高活性菌株LTS-6-6發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性物質(zhì)主要是多酚類和黃酮類。

2.2.2 不同濃度LTS-6-6萃取物對DPPH·的清除率

高活性菌株LTS-6-6不同濃度萃取物對DPPH·清除率見表3和圖5。

表3 不同部位萃取物對DPPH·清除率

續(xù)表3(Continued Tab.3)

濃度Concentration(mg/mL)供試樣品清除率Scavenging effects of different samples(%)VCPEEEAEBAEWTE0.04096.74±0.0065.20±2.7494.94±0.3553.12±0.0919.79±0.420.05096.89±0.0474.78±0.4395.02±0.0264.36±2.6326.46±1.050.10097.10±0.0391.68±0.1497.79±2.4794.79±0.0050.45±0.00

圖5 高活性菌株不同萃取物對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of different extracts from LTS-6-6 on DPPH· radical

由表3和圖5可看出，高活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物不同萃取物對DPPH·均表現(xiàn)出一定的清除能力，清除率都隨著濃度增大而升高，增大幅度均呈現(xiàn)出先逐漸增大后趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象。在0～0.1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，EAE活性顯著高于其他萃取物；在0.02 mg/mL時，EAE對DPPH·的清除率即達(dá)到88.97%，其EC50為7 μg/mL，僅次于VC(EC50為4 μg/mL)。在0.1 mg/mL時，PEE和BAE對DPPH·的清除率分別為91.81%和94.79%，EC50分別為26 μg/mL和33 μg/mL。WTE對DPPH·的清除能力最弱，在0.1 mg/mL時清除率僅為50.44%，EC50為109 μg/mL。由此看出，不同萃取物中，對DPPH·清除能力由高到低依次為EAE>PEE>BAE>WTE，說明抗氧化活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯萃取相。這與圖4所示乙酸乙酯萃取相中總酚和總黃酮含量最高的結(jié)果相一致。這為高活性菌株LTS-6-6中的抗氧化活性物質(zhì)的后續(xù)分離純化提供了重要參考依據(jù)。

3 結(jié)果與討論

本研究采用總還原力測定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率評價了29株核桃內(nèi)生真菌的抗氧化能力，供試菌株均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，其中以核桃青果皮中分離得到的菌株LTS-6-6抗氧化能力最強(qiáng)。

抗氧化劑可以抑制自由基的反應(yīng)過程或干擾自由基連鎖反應(yīng)的引發(fā)與擴(kuò)散過程，本研究以總還原力測定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率兩種方法，對核桃內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行探索，由于兩者的抗氧化作用機(jī)制不同，研究結(jié)果也稍有差異。本研究結(jié)果顯示，BAE的總還原力高于PEE，但在DPPH·清除試驗中，BAE的清除能力較弱，EC50略高于PEE。

部分內(nèi)生真菌能夠參與植物活性成分的合成，產(chǎn)生與宿主植物相同的化合物及其衍生物[15]。Wei等[16]通過DPPH·及ABTS+·法評價了核桃青皮的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃青皮80%乙醇提物抗氧化能力與VC相當(dāng)，并且總酚含量和抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系。在本試驗中，高活性菌株LTS-6-6從核桃青果皮中分離得到，其發(fā)酵產(chǎn)物也表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，這可能與宿主共生理論有關(guān)。另外，Pan等[17]報道的川貝母內(nèi)生真菌中的抗氧化活性成分為多酚類、黃酮類物質(zhì)。Huang等[18]研究了29株傳統(tǒng)中草藥分離到的內(nèi)生真菌的抗氧化活性，并發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和發(fā)酵液中的多酚含量相關(guān)性較好。本研究結(jié)果與其一致。

核桃是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,種植范圍廣泛，內(nèi)生真菌資源豐富。Liu等[19]采用組織分離法對藍(lán)田不同季節(jié)核桃樹的不同組織部位內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，共分離獲得隸屬于47個屬的核桃內(nèi)生真菌676株；Yimaer等[20]研究了陜西山陽縣、藍(lán)田縣與宜君縣不同生境春季核桃內(nèi)生真菌的多樣性，從576塊組織塊中共分離得到392株內(nèi)生真菌。本研究僅從實(shí)驗室保存的大量菌株中選擇了29株進(jìn)行抗氧化活性的探索，可供篩選菌株還很多，有望從中發(fā)現(xiàn)更有潛在價值的高活性菌株。