茶樹(shù)黃酮醇苷的合成代謝及檢測(cè)分析研究進(jìn)展

魏沙沙 ，陳志丹,4，孫威江,4*

1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2福建省安溪縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園協(xié)同創(chuàng)新中心，泉州 362400；3福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福州 350002；4福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，泉州 362400

黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)受茶葉品種、葉片成熟度、采收季節(jié)和茶葉加工工藝等因素影響，至今已在不同茶葉中報(bào)道了超過(guò)二十多種黃酮醇苷[13]，雖然黃酮醇及其糖苷類(lèi)物質(zhì)已逐漸引起研究者的關(guān)注，但目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中在茶樹(shù)體內(nèi)黃酮醇苷的檢測(cè)方法、保健功效及影響因素的探究，對(duì)其合成途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)等研究還未深入。

1 茶樹(shù)黃酮醇苷成分和含量差異的影響因素

1.1 茶樹(shù)品種

黃酮醇及其糖苷物質(zhì)在茶樹(shù)品種之間的差異很大，可以作為區(qū)分茶樹(shù)起源或栽培品種類(lèi)型的有效生物標(biāo)志物[14-16]。Zheng等[16]探究了不同栽培品種對(duì)黃酮醇苷和兒茶素組成的影響，結(jié)果顯示無(wú)論總量還是單體的含量，黃酮醇苷在茶樹(shù)品種間的變化大于兒茶素，可用于區(qū)分不同茶樹(shù)栽培品種。Monobe等[17]篩選了高黃酮醇含量的品種“Saemidori”、“Sofu”、“Surugawase”、“Fukumidori”和“Asatsuyu”，“Saemidori”和“Sofu”中的槲皮素糖苷含量較高(110170 μg/mL)，被認(rèn)為是槲皮素的有效來(lái)源。Tian等[18]在云南熟普中鑒定出10種黃酮醇苷(8-17)，其中黃酮醇苷(8-11)首次在茶樹(shù)中被鑒定出。茶樹(shù)品種不同，黃酮醇的種類(lèi)和含量存在明顯差異，Zhao等[19]檢測(cè)武夷巖茶和武夷水仙兩份茶葉樣品，發(fā)現(xiàn)表兒茶素沒(méi)食子酸(epicatechin gallate，ECG)、楊梅素糖苷等物質(zhì)可能是影響兩種茶葉獨(dú)特風(fēng)味的主要因素。Li等[20]檢測(cè)了13個(gè)茶樹(shù)品種的差異代謝物以全面了解適制綠茶品種(GT)和適制紅綠茶品種(G&BT)之間的差異，結(jié)果表明所有芹菜素糖苷和楊梅素糖苷(楊梅素3-半乳糖基蕓香苷除外)、三種槲皮素糖苷在GT栽培品種中更高；代謝途徑分析表明，黃酮類(lèi)化合物途徑傾向于GT品種中黃酮醇苷的合成，而傾向于G&BT品種中兒茶素和酚酸的合成，該研究結(jié)論也為茶樹(shù)品種適制性和品種調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1.2 茶葉產(chǎn)品種類(lèi)

不同的茶葉產(chǎn)品種類(lèi)中黃酮醇苷的含量及組成有差異，白茶中壽眉和白牡丹中山奈酚-O-糖苷、槲皮素-O-糖苷和楊梅素-O-葡萄糖苷含量均高于白毫銀針，而山奈酚3-(6″-沒(méi)食子酰葡糖苷)、山奈酚7-(6″-沒(méi)食子酰葡糖苷)和槲皮素3-O-半乳糖苷在銀針中含量最高[21]。Bai等[22]在六安瓜片中鑒定出21種黃酮醇及糖苷類(lèi)物質(zhì)，其中4種是酰化物質(zhì)、12種化合物是異構(gòu)體組，并且發(fā)現(xiàn)了一種新型?；S酮醇四糖苷：山奈酚3-O-[(E)-p-香豆酰-(1→2)][α-L-阿拉伯吡喃糖基-(1→3)][β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(camellikaempferoside C，1)。Tian 在茯磚茶(FBT)中鑒定出一種新的酰化黃酮醇糖苷：山奈酚3-O-[Ep-香豆酰-(→2)][α-1-阿拉伯吡喃糖基-(1→3)][α-1-吡喃吡喃糖基(1→6)]-β-二吡喃葡萄糖苷，命名為camellikaempferoside A，從FBT中與camelliquercetiside C一起分離[23]。Pedan[24]在陳年生普茶(APT)和新熟普茶(YPT)中首次鑒定了黃酮醇及其苷元，如槲皮素-半乳糖苷(Q-gal)、槲皮素-葡萄糖苷(Q-glu)等，發(fā)現(xiàn)在APT中黃酮醇苷含量始終高于YPT，但是YPT中含有的槲皮素和山奈酚高于APT，結(jié)合PCA和HCA分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素和山奈酚可以作為區(qū)別YPT和APT的化學(xué)標(biāo)記物，為多變量因子表征不同茶葉品類(lèi)開(kāi)辟了新途徑。

1.3 茶葉加工工藝

已有一些研究者研究了茶葉的加工工藝對(duì)黃酮醇糖苷組成的影響[25-29]，但實(shí)驗(yàn)的商品茶通常是從不同的廠家和公司收集[25,30]，難以控制茶葉品種和葉片成熟度，而這兩者都影響黃酮醇糖苷的組成。Fang等[4]用福鼎大白品種分別制成綠茶、黃茶、白茶、烏龍茶和紅茶，探究黃酮醇苷在加工過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示紅茶總黃酮糖苷含量最低(9.83 mg/g)，其次是烏龍茶(11.96 mg/g)；殺青工序因高溫使酶失活，對(duì)保持黃酮糖苷的穩(wěn)定起重要作用；在紅茶發(fā)酵和干燥過(guò)程中，楊梅素糖苷、槲皮素糖苷及單糖苷、二糖苷、三糖苷大量損失，而山奈酚糖苷的含量保持相對(duì)穩(wěn)定，表明發(fā)酵和干燥工序是導(dǎo)致加工過(guò)程中黃酮糖苷大量減少的關(guān)鍵因素。Bai等[22]用龍井長(zhǎng)葉品種分別制成白茶、綠茶、黃茶、紅茶、黑茶和烏龍茶，發(fā)現(xiàn)9種黃酮醇苷在這六大茶類(lèi)中分布呈多樣性，山奈酚3-O-葡萄糖基蕓香苷在六種茶類(lèi)中含量最高，槲皮素3-O-葡萄糖基蕓香苷次之，二者含量都隨著發(fā)酵程度的增加而減少，并且認(rèn)為它們可以區(qū)別不同加工類(lèi)型的茶葉。Liu等[31]研究了不同半發(fā)酵時(shí)間處理的鐵觀音烏龍茶黃酮醇苷的變化，發(fā)現(xiàn)隨著半發(fā)酵時(shí)間的增加，楊梅素、楊梅素-鼠李糖、槲皮素-蕓香苷的含量大大降低，而槲皮素、山奈酚、山奈酚-半乳糖、山奈酚-蕓香苷顯著增加。

1.4 茶葉生產(chǎn)季節(jié)

黃酮醇苷的含量隨著季節(jié)性變動(dòng)。Dai等[32]比較了春季、夏季和秋季采摘的9個(gè)品種的綠茶代謝物譜圖，發(fā)現(xiàn)槲皮素-O-糖苷表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性波動(dòng)，且黃酮醇及其糖苷的變化趨勢(shì)由其苷元決定：如山奈酚-O-糖苷(山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-葡萄糖基-蕓香苷和山奈酚-3-半乳糖基-蕓香苷)在夏茶樣品中含量最低，春、秋茶樣品之間無(wú)明顯差異，而夏季茶葉中槲皮素-O-糖苷(槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-半乳糖基-蕓香苷和槲皮素3-O-葡萄糖基-蕓香苷)的含量高于秋季茶葉中的含量。綠茶的感官品質(zhì)在春季不同時(shí)期變化較大，Liu等[33]對(duì)早春、中春和晚春季節(jié)采摘的幼嫩枝葉進(jìn)行代謝物分析，顯示晚春季節(jié)茶葉碳水化合物、黃酮類(lèi)及其糖苷含量大量提高，三羧酸循環(huán)和光呼吸強(qiáng)烈增強(qiáng)，從而提高了所制茶葉的感官品質(zhì)。

1.5 茶樹(shù)組織部位

不同的茶葉組織部位黃酮醇苷的含量不同，總體呈現(xiàn)出在茶樹(shù)嫩葉的含量高于成熟葉。黃酮醇單糖苷、二糖苷和三糖苷主要積累在茶樹(shù)的幼葉中，在老莖和根中含量極低[3]。Wu等[34]在茶樹(shù)鮮葉中鑒定了13種黃酮醇及其糖苷物質(zhì)，第二葉位總黃酮醇苷含量最高(4 018.0 μg/g)，其次是第四葉和第六葉，芽中含量最低(1 780.0 μg/g)，Li等[35]的研究也得出相似結(jié)果，在成熟葉和幼嫩葉中檢測(cè)到比莖和根含量更高的黃酮醇。與山奈酚和楊梅素相比，槲皮素是黃酮醇類(lèi)中含量最為豐富的一類(lèi)物質(zhì)，成熟葉中的槲皮素和楊梅素與幼葉相比顯著增加，而幼葉中山奈酚的含量比成熟葉高。蘆丁(二糖苷)在茶樹(shù)成熟葉中的含量大約是幼葉的兩倍，在茶樹(shù)中僅檢測(cè)到少量的槲皮素單糖苷，這些研究結(jié)果揭示了茶樹(shù)中黃酮醇糖苷分布的時(shí)空變化。

1.6 溫度與光照

溫度和光照均影響黃酮醇苷的含量。Zhang等[36]分析了遮光處理下光強(qiáng)和溫度對(duì)茶葉中黃酮醇苷的影響，發(fā)現(xiàn)在遮蔭處理中黃酮醇及其糖苷含量顯著下降，而適當(dāng)?shù)母邷赜欣邳S酮醇苷的積累，尤其是山奈酚3-bd-吡喃葡萄糖苷，對(duì)光強(qiáng)變化的敏感性高于對(duì)溫度變化。光為植物的生長(zhǎng)和發(fā)育提供能量，然而過(guò)量的光會(huì)導(dǎo)致光損傷，因此避免光脅迫對(duì)植物至關(guān)重要[37-39]，黃酮類(lèi)化合物對(duì)茶樹(shù)光保護(hù)的作用已有大量研究[40]。與具有單羥基的類(lèi)黃酮相比，B環(huán)中具有鄰二羥基結(jié)構(gòu)的類(lèi)黃酮在葉片中優(yōu)先積累[41]，Zhang等[42]發(fā)現(xiàn)與正常綠葉相比，光敏型黃化茶“黃金芽”葉片中二羥基黃酮類(lèi)化合物含量較高，主要是槲皮素及其糖苷(槲皮素3-半乳糖苷，槲皮素4′，7-二葡萄糖苷等)，而楊梅素及其糖苷(楊梅素3-阿拉伯糖苷，楊梅素3，3′-二半乳糖苷等)的含量低于正常綠葉，表明二羥基黃酮類(lèi)化合物在茶葉中的功能存在很大差異，特別是槲皮素及其糖苷在黃化葉中對(duì)光保護(hù)及清除活性氧自由基有巨大作用。

1.2.2 腸外營(yíng)養(yǎng) 采取全腸外營(yíng)養(yǎng)支持，靜脈營(yíng)養(yǎng)配伍方案與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組相同，總熱量約為110kj/（kg·d），給予靜脈支持。

1.7 其它因素

Qi等[43]分析了不同砧木對(duì)新鮮茶葉中代謝物的不同影響，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異代謝物屬于茶多酚(黃烷-3-醇，黃酮，黃酮醇等)，表明嫁接的影響主要集中在多酚相關(guān)的途徑。Dong等[44]探究了“龍井43”茶樹(shù)中黃酮醇及其糖基化衍生物對(duì)缺氮、正常氮、過(guò)量氮供應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)用正常氮處理時(shí)，大多數(shù)黃酮醇糖苷(槲皮素-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-葡萄糖基-鼠李糖苷-葡萄糖苷)積累到最高水平。而黃酮醇糖苷的碳水化合物底物水平(如蔗糖、蔗糖-6-磷酸、D-果糖1，6-二磷酸和葡萄糖-1-磷酸)與黃酮醇糖苷含量呈正相關(guān)，表明正常的氮水平下茶樹(shù)通過(guò)基因調(diào)節(jié)底物含量來(lái)促進(jìn)黃酮醇糖苷的生物合成，而異常的氮處理，尤其是過(guò)量氮處理則具有抑制作用。

2 黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)方法

由于茶葉中黃酮糖苷的種類(lèi)非常多，又缺少相應(yīng)的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，因此建立一種快速且成本低廉的方法來(lái)檢測(cè)茶葉中的黃酮醇苷非常重要。隨著物質(zhì)分離檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜、超高效液相色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)逐漸應(yīng)用于茶葉中黃酮醇苷的定性與定量研究。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是在傳統(tǒng)液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)方法，具有檢測(cè)限制低、靈敏度高、分析效率高等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜儀常與紫外(UV)、二極管陣列(DAD)等檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合使用，成為分析茶樹(shù)中黃酮醇苷物質(zhì)最有效的定量定性分析技術(shù)之一。Fanali[45]用一種標(biāo)準(zhǔn)品的UV吸收來(lái)量化黃酮醇苷元的其他糖苷物質(zhì)，以這種方式在白茶樣品中定量了十種黃酮醇糖苷。Lakenbrink為了保證樣品的純度，在檢測(cè)時(shí)利用聚酰胺柱層析進(jìn)行了前處理[46]，Hilal[47]使用聚酰胺、Sephadex LH 20色譜和制備型HPLC在白茶中鑒定出新的楊梅素三糖苷(鼠李糖苷)，在烏龍茶中檢測(cè)到新型乙酰化黃酮醇四糖苷。早期研究報(bào)道中多使用糖苷配基作為標(biāo)準(zhǔn)溶液定量黃酮醇苷，或者是制備茶葉提取液分離黃酮醇苷然后量化。然而一些黃酮醇糖苷在茶樹(shù)中微量積累，不能在單次HPLC運(yùn)行中有效分離和精確定量。因此，在現(xiàn)有的分離檢測(cè)體系下建立更加高效的分析技術(shù)和設(shè)備方法成為黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)分析的必然趨勢(shì)。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法

液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、離子碎片以及物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，同時(shí)具有高效、抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)該技術(shù)已運(yùn)用于茶樹(shù)中黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)的鑒定[48]，在綠茶和紅茶中鑒定了19種黃酮醇糖苷[49]，其中14種被確定為紅茶中澀味的主要貢獻(xiàn)者[2]。Sultana等[50]采用HPLC-UV/ESI-MS同時(shí)對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶中的黃酮醇等24種酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，不僅能區(qū)分不同品種茶葉中的酚類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成，在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，還可以根據(jù)色譜的保留時(shí)間和碎片離子鑒定目標(biāo)化合物。Rha[51]用HPLC-MS法鑒定了綠茶中16種黃酮醇糖苷，證明此方法作為檢測(cè)茶葉中黃酮醇苷組分穩(wěn)定有效。但其操作難度大、儀器成本高，且難以對(duì)一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物進(jìn)行有效識(shí)別，目前的應(yīng)用還有很大的發(fā)展空間。

2.3 超高效液相色譜

超高效液相色譜(UPLC)是在HPLC的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，具有高效快速、分辨率高、靈敏度好等特點(diǎn)。Jiang等[28]首次采用UPLC法對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶的黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜識(shí)別了18種黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)綠茶中主要以山奈酚糖苷為主，烏龍茶則以槲皮素和楊梅素糖苷為主，紅茶中以槲皮素糖苷為主，表明黃酮醇苷可以作為區(qū)別不同品種的標(biāo)志物質(zhì)。QQQ-MS/MS是一種串聯(lián)質(zhì)譜儀，可以分析和提供分子離子特征產(chǎn)物離子的信息，其MRM模式是一種高靈敏度的方法[52]。Wu、Dong等[3,44]建立了UPLC-QQQ-MS/MS MRM模式的方法，測(cè)定了不同茶樹(shù)品種的黃酮醇苷類(lèi)化合物。Bai等[22]建立的UPLC方法可以在六種加工類(lèi)型的茶中同時(shí)測(cè)定含有一至四個(gè)糖單元的不同黃酮醇糖苷的方法。Zhao、Wu等也利用UHPLC-DAD-MS/MS對(duì)不同茶葉中黃酮醇糖苷的鑒定和測(cè)定進(jìn)行了多項(xiàng)研究[53-56]。超高效液相色譜法以其操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)時(shí)間短高效，對(duì)目標(biāo)化合物的分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為茶樹(shù)中黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)的有力方法之一。

3 黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶類(lèi)

3.1 黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)合成上游途徑的相關(guān)酶

茶樹(shù)中黃酮醇的生物合成途徑是類(lèi)黃酮化合物代謝途徑的一個(gè)分支，由苯丙氨酸途徑經(jīng)丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)產(chǎn)生柚皮素查耳酮，之后在查耳酮異構(gòu)酶(CHI)催化下被特異環(huán)化形成柚皮素，然后在一種或多種黃烷酮羥化酶(F3H)或類(lèi)黃酮羥化酶(類(lèi)黃酮3′-羥化酶，F(xiàn)3′H和類(lèi)黃酮3′，5′-羥化酶，F(xiàn)3′5′H)催化下產(chǎn)生不同的二氫黃酮醇，如二氫山柰酚、二氫槲皮素、二氫楊梅素等。二氫黃酮醇可以在黃酮醇合成酶(FLS)作用下氧化形成黃酮醇苷元，然后在尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)催化下發(fā)生糖基化等修飾，形成穩(wěn)定多樣的黃酮醇衍生物[57]。

3.2 黃酮醇苷合成途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶

3.2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶的分類(lèi)

茶樹(shù)中的黃酮類(lèi)化合物有黃烷-3-醇、酚酸、花青素和黃酮醇等，賦予茶獨(dú)特的風(fēng)味，使茶湯苦味和澀味之間取得平衡。大多數(shù)的黃酮類(lèi)化合物在黃酮類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶作用下以糖苷形式存在于植物中，增加了其穩(wěn)定性、溶解性以及生物利用度[58]；在茶樹(shù)中，黃酮醇糖苷物質(zhì)的上游合成途徑已基本明了，但將黃酮醇苷元催化形成黃酮醇衍生物的UGTs還處于研究的初級(jí)階段。由于UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是由多基因家族編碼，所以難以篩選茶樹(shù)中特異性參與黃酮醇化合物的目標(biāo)UGT基因。迄今為止，基于高度保守的PSPG基序，已經(jīng)從各種植物基因組中鑒定了超過(guò)1500個(gè)推測(cè)的UGT基因，這些UGT序列已被分為16個(gè)不同的組(從A到P)[59]。Noguchi等[60]將黃酮類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶分為四個(gè)官能團(tuán)，命名為簇I、II、IIIa、IIIb和IV，推測(cè)四組轉(zhuǎn)移酶分別編碼3-O、5-O和7-O糖基轉(zhuǎn)移酶和二糖苷/二糖鏈糖基轉(zhuǎn)移酶。

3.2.2 茶樹(shù)中鑒定出的糖基轉(zhuǎn)移酶

在茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn)的178個(gè)UGT基因中，很少具有功能特征[61]。Jiang等[62]從茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出132個(gè)UGT基因(CsUGT)，其中CsUGT73A20、CsUGT75L12、CsUGT78A14和CsUGT78A15被分類(lèi)到不同的簇中，這些CsUGT是導(dǎo)致茶樹(shù)中不同組織器官中不同黃酮醇糖苷的積累的原因。

3.2.3 CsUGT78A14、CsUGT78A15基因與黃酮醇苷合成

在茶樹(shù)中，黃酮類(lèi)化合物主要以3-O-葡萄糖苷[62]的形式存在，其可能是由未成熟葉片中的CsUGT78A14和CsUGT78A15產(chǎn)生。研究表明，CsUGT78A14在3-OH糖基化位點(diǎn)用UDP-葡萄糖作為糖供體促進(jìn)了黃酮醇葡萄糖苷的合成，CsUGT78A15則以UDP-半乳糖作為糖供體促進(jìn)黃酮醇半乳糖苷的增加。在過(guò)表達(dá)CsUGT78A14、CsUGT78A15兩個(gè)基因的擬南芥和煙草中，鑒定出黃酮醇苷山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷，分別為這兩個(gè)基因的催化產(chǎn)物，即CsUGT78A14和CsUGT78A15的酶特異性的產(chǎn)生具有區(qū)域選擇性的3-O-葡糖苷/半乳糖苷[61]。

3.2.4 CsUGT73A20與黃酮醇苷的合成

有研究發(fā)現(xiàn)，在CsUGT73A20表達(dá)的植物中，參與3-OH和7-OH位點(diǎn)的糖基化反應(yīng)的黃酮醇糖苷的含量顯著增加，但黃烷-3-醇的含量降低[62]。Zhao等[60]從茶樹(shù)中分離出屬于簇IIIa的黃酮醇糖基轉(zhuǎn)移酶(CsUGT73A20)，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出廣泛的底物耐受性，對(duì)黃酮醇(山奈酚，槲皮素和楊梅素)，黃酮(芹菜素)和黃烷酮(柚皮素)具有活性，其中山奈酚是最佳底物，使用UDP-半乳糖作為糖供體時(shí)，未檢測(cè)到產(chǎn)物。體外實(shí)驗(yàn)表明，CsUGT73A20對(duì)黃酮醇化合物進(jìn)行多位點(diǎn)糖苷化，主要形成3-O-葡萄糖苷和7-O-葡萄糖苷。pH對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的活性也有影響，CsUGT73A20在pH8.0下積累的K7G產(chǎn)物更多，但K3G是pH9.0時(shí)的主要產(chǎn)物，高pH抑制體外7-OH位點(diǎn)的糖基化反應(yīng)。在過(guò)量表達(dá)CsUGT73A20的煙草中，生成一種新的槲皮素-3-O-鼠李糖苷-7-O-鼠李糖苷(Q-3-R-7-R)黃酮醇糖苷[62]。

3.2.5 CsUGT78A17與黃酮醇苷的合成

Ohgami[63]發(fā)現(xiàn)UGT73A17基因在成熟葉中高豐度表達(dá)，隨著葉片成熟，其表達(dá)量與槲皮素糖苷的積累曲線一致，表明UGT73A17部分參與茶樹(shù)中黃酮醇糖基化。Su[64]進(jìn)一步鑒定了UGT73A17基因，其負(fù)責(zé)多種類(lèi)黃酮糖苷的生物合成，序列分析表明UGT73A17蛋白在氨基酸水平上與7-O-糖基轉(zhuǎn)移酶顯示出高度同一性，并且它與其他植物物種的幾種7-O-糖基轉(zhuǎn)移酶聚集在同一進(jìn)化枝中。rUGT73A17在高溫(例如50 ℃)下的活性高于低溫時(shí)的活性，表明UGT73A17負(fù)責(zé)多種黃酮糖苷的生物合成，也與茶樹(shù)的熱響應(yīng)和品質(zhì)有關(guān)。CsUGT73A17比目前在茶樹(shù)中鑒定的其他UGT具有更廣泛的底物特征，體外酶促測(cè)定還證實(shí)，CsUGT73A17主要產(chǎn)生7-O-葡糖苷，產(chǎn)生少量的3，3′-，4′-O-葡糖苷；從酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果來(lái)看，CsUGT73A17對(duì)所有黃酮醇和黃酮底物顯示出較高的親和力和較低的Km值，但CsUGT73A20似乎對(duì)山奈酚比對(duì)其他底物更具活性。CsUGT73A17類(lèi)似于CsUGT73A20，也主要產(chǎn)生7-O-葡萄糖苷，但是含有少量的3-O-葡萄糖苷[30]。CsUGT78A14和CsUGT78A15以及CsUGT73A20都不能在成熟葉片中高度表達(dá)，而蘆丁在成熟葉中高水平積累[65]，UGT73A17也在成熟葉中高度表達(dá)，所以猜測(cè)UGT73A17可能是產(chǎn)生蘆丁的原因[64]。

3.2.6 CsUGT75L12與黃酮醇苷的合成

研究證實(shí)CsUGT75L12是黃酮醇7-O-糖基轉(zhuǎn)移酶。Dai等[66]在大腸桿菌中表達(dá)的重組CsUGT75L12蛋白在7-OH位置對(duì)多個(gè)酚類(lèi)底物表現(xiàn)出葡萄糖基化活性，但花青素，兒茶素和酚酸除外。在過(guò)表達(dá)CsUGT75L12的擬南芥植物中，槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-吡喃葡萄糖苷和山奈酚3-O-鼠李糖苷-7-O-吡喃葡萄糖苷的積累被顯著促進(jìn)。

3.2.7 CsUGT72AM1與黃酮醇苷的合成

Zhao等[67]從茶樹(shù)中分離出屬于簇IIIb的糖基轉(zhuǎn)移酶(CsUGT72AM1)，rCsUGT72AM1可以在體外對(duì)黃酮醇進(jìn)行糖苷化，分別形成3-O-葡萄糖苷或4-O-葡萄糖苷。這種酶對(duì)黃烷酮也可以進(jìn)行多位點(diǎn)糖苷化，產(chǎn)物是柚皮素-7-O-葡糖苷和-4′-O-葡糖苷。此外，在用花青素作為底物的酶測(cè)定中，CsUGT72AM1的糖基化活性被高濃度的花色素苷顯著抑制。He[68]從龍井43品種的天然雜交種群中獲得了一種新的紫葉茶品種“Mooma1”，HPLC和LC-MS分析顯示花青素和O-糖基化黃酮醇在“Mooma1”葉片中顯著積累，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出紫葉茶中的一個(gè)新的UGT基因(CsUGT72AM1)，體外酶促測(cè)定證實(shí)CsUGT72AM1具有作為黃酮醇3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，并顯示出廣泛的底物特異性。

4 展望

黃酮醇及糖苷物質(zhì)作為參與茶樹(shù)抵抗逆境及茶葉滋味、色澤及具有保健功能的次生代謝物，其在不同茶樹(shù)品種、加工工藝、茶葉品類(lèi)的合成、積累已有一些研究基礎(chǔ)，黃酮醇類(lèi)物質(zhì)與多種環(huán)境因子均有互作[69]，其生物合成的環(huán)境調(diào)控因素研究目前以光照和溫度為主，但其他環(huán)境脅迫因素如CO2、干旱或水澇、病蟲(chóng)害等生物脅迫對(duì)黃酮醇生物合成的影響方面的探索較少。黃酮醇類(lèi)化合物種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏使其定性和定量檢測(cè)工作比較困難。近年來(lái)高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法、高效液相色譜法等多種方法已在茶樹(shù)黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定過(guò)程中得到應(yīng)用，但今后的研究還需使用多種檢測(cè)儀器建立更加高效便捷的檢測(cè)方法，加強(qiáng)分析檢測(cè)工作的系統(tǒng)性和精確性。黃酮醇及糖苷生物合成途徑中已有諸多基因被克隆、鑒定及部分功能驗(yàn)證，但由于該通路代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，各基因間協(xié)同表達(dá)及調(diào)控機(jī)制尚較模糊。在不同條件下，多轉(zhuǎn)錄因子互作及其對(duì)黃酮醇及糖苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控機(jī)制有待闡明。在今后的研究中，應(yīng)將檢測(cè)分析及代謝途徑和關(guān)鍵基因表達(dá)相結(jié)合，從根本上解決茶樹(shù)黃酮醇及糖苷類(lèi)物質(zhì)的積累及代謝調(diào)控的有關(guān)問(wèn)題，為篩選黃酮醇類(lèi)物質(zhì)特異性積累的茶樹(shù)種質(zhì)資源以及膳食性黃酮醇食品的利用和品質(zhì)提升奠定基礎(chǔ)。