丹葛酚酮膠囊HPLC指紋圖譜及9種有效成分的含量測(cè)定

劉小艷，黃志芳，羅春梅，劉玉紅，劉云華，陳 燕，湯依娜，易進(jìn)海*

1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，瀘州 646000；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041

丹葛酚酮膠囊為重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目研制的組分中藥新藥，有效組分為丹參總酚酸、總丹參酮和葛根總黃酮，具有和血滋陰，通絡(luò)止痛之功效，用于糖尿病周?chē)窠?jīng)病變屬陰虛血瘀證，已獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局臨床批件(2018L02595)。本品中丹參總酚酸主要成分有迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B等，具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈及抗血栓形成等作用[1-4]；總丹參酮主要含丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等，具有抗氧化、消炎抑菌、心臟保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[1,2,4,5]；葛根總黃酮主要成分有3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷等，具有降低血管阻力，改善心腦血液循環(huán)、降低心機(jī)耗氧量等作用[6-8]。

中藥指紋圖譜能很好地表征中藥復(fù)方的整體質(zhì)量概貌，且已廣泛應(yīng)用于各種中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制[9-12]。為了更全面地建立丹葛酚酮膠囊的質(zhì)量控制方法，利用指紋圖譜整體性和模糊性的特點(diǎn)，結(jié)合多指標(biāo)有效成分的定量分析進(jìn)行產(chǎn)品一致性評(píng)價(jià)，本文建立了丹葛酚酮膠囊的HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定制劑中葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA9種主要有效成分的含量，對(duì)控制產(chǎn)品批次間的差異，保證其質(zhì)量可控、穩(wěn)定、安全有效具有重要意義。本文所建立的方法操作簡(jiǎn)便，特征性強(qiáng)，能夠較全面地表征主要活性成分的含量差異，以期為該新藥的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent科技公司)；SECURA225D-1CN電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Integral 3型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥

3′-羥基葛根素對(duì)照品(批號(hào)：DST180912-075)、葛根素-6′′-O-木糖苷對(duì)照品(批號(hào)：DST190110-054)、3′-甲氧基葛根素對(duì)照品(批號(hào)：DST190115-122)、葛根素芹菜糖苷對(duì)照品(批號(hào)：DST190116-055)、刺芒柄花苷對(duì)照品(批號(hào)：DST190114-044)、隱丹參酮對(duì)照品(批號(hào)：MUST-18041115)、丹參酮Ⅰ對(duì)照品(批號(hào)：MUST-18032207)、二氫丹參酮Ⅰ對(duì)照品(批號(hào)：MUST-18032705)、紫草酸對(duì)照品(批號(hào)：MUST-14052702)均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%；葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-20161，純度：95.4%)、大豆苷對(duì)照品(批號(hào)：111738-201603，純度：93.3%)、染料木苷對(duì)照品(批號(hào)：111709-201702，純度：99.9%)、丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：110766-201520，純度：98.9%)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：111562-201716，純度：94.1%)、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)：111871-201706，純度：90.5%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；亞甲基丹參醌對(duì)照品(批號(hào)：180912A，純度：98%)，購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司。乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純；水(超純水，超純水機(jī)制得)。10批丹葛酚酮膠囊由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院制備(每粒裝0.39 g，編號(hào)S1～S10)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.05%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～3 min，3% B；3～5 min，3% B→11% B；5～25 min，11% B；25～30 min，11% B→20% B；30～38 min，20% B；38～50 min，20% B→32% B；50～60 min，32% B→52% B；60～80 min，52% B→68% B；80～90 min，68% B→70% B)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，加入70%甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分別含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA1.214、2.333、0.685、0.641、1.564、2.350、0.641、0.107、0.581 mg的儲(chǔ)備液；分別精密量取以上對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于5 mL量瓶中，70%甲醇定容，制得每1 ml分別含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA73.6、440.1、97.9、130.8、117.3、499.5、13.0、6.5、23.5 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取丹葛酚酮膠囊內(nèi)容物約40 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按照丹葛酚酮膠囊處方和制法，參照“2.3”供試品溶液的制備方法，分別制備缺丹參、葛根的陰性對(duì)照溶液。

2.5 HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取同一供試品(S5)溶液，依照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以丹酚酸B為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<2%(n=6)，表明儀器精密度好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(S5)溶液，依照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，以丹酚酸B為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<2%(n=6)，表明供試品溶液于24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一丹葛酚酮膠囊(S5)內(nèi)容物約40 mg，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次測(cè)定，丹酚酸B為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<2%(n=6)，表明該方法重復(fù)性好。

2.6 指紋圖譜建立、相似度分析及共有峰確認(rèn)

2.6.1 相似度評(píng)價(jià)

依照“2.3”項(xiàng)下方法分別制備10批丹葛酚酮膠囊供試品溶液(編號(hào)S1～S10)，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次測(cè)定，記錄100分鐘的HPLC圖。將得到的10批色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1和圖2。計(jì)算S1～S10批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度(見(jiàn)表1)。10批丹葛酚酮膠囊指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度均大于0.99，表明各批次丹葛酚酮膠囊樣品之間的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表1 10批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖1 10批丹葛酚酮膠囊HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of Dangefentong Capsules

2.6.2 共有峰指認(rèn)與歸屬

通過(guò)建立丹葛酚酮膠囊指紋圖譜的共有模式，從10批樣品圖譜的共有指紋區(qū)標(biāo)定了28個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)并結(jié)合DAD光譜，確認(rèn)出其中16個(gè)色譜峰，分別為3號(hào)峰3′-羥基葛根素、5號(hào)峰葛根素、6號(hào)峰葛根素-6′′-O-木糖苷、7號(hào)峰3′-甲氧基葛根素、8號(hào)峰葛根素芹菜糖苷、9號(hào)峰大豆苷、13號(hào)峰染料木苷、16號(hào)峰迷迭香酸、17號(hào)峰紫草酸、19號(hào)峰刺芒柄花苷、20號(hào)峰丹酚酸B、23號(hào)峰二氫丹參酮Ⅰ、25號(hào)峰隱丹參酮、26號(hào)峰丹參酮Ⅰ、27號(hào)峰亞甲基丹參醌、28號(hào)峰丹參酮ⅡA。再結(jié)合陰性對(duì)照?qǐng)D譜、丹葛酚酮膠囊指紋圖譜，28個(gè)共有峰都可以找到明確歸屬，其中1～15、18、19、21號(hào)峰為葛根黃酮成分，16、17、20、22號(hào)峰為丹參酚酸成分，23～28號(hào)峰為丹參酮成分(見(jiàn)圖3)。

圖2 對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint

圖3 對(duì)照品、陰性對(duì)照及供試品指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of reference substance,negative controls and test sample注：3.3′-羥基葛根素；5.葛根素；6.葛根素-6′′-O-木糖苷；7.3′-甲氧基葛根素；8.葛根素芹菜糖苷；9.大豆苷；13.染料木苷；16.迷迭香酸；17.紫草酸；19.刺芒柄花苷；20.丹酚酸B；23.二氫丹參酮Ⅰ；25.隱丹參酮；26.丹參酮Ⅰ；27.亞甲基丹參醌；28.丹參酮ⅡA；A.對(duì)照品；B.缺葛根陰性對(duì)照；C.缺丹參陰性對(duì)照；D.供試品。Note： 3.3′-hydroxy puerarin;5.Puerarin;6.Puerarin-6′′-O-xyloside;7.3′-methoxy puerarin;8.Puerarin celery glycoside;9.Daidzin;13.Dye Lignin;16.Rosmarinic acid;17.Lithosperic acid;19.Thorn stalk;20.Salvianolic acid B;23.dihydrotanshinone I;25.Cryptotanshinone;26.Tanshinone I;27.Kedan Ginseng;28.Tanshinone IIA;A.reference substance;B.lack of Radix Puerariae Lobatae negative control;C.lack of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae negative control;D.test sample

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 陰性干擾試驗(yàn)

精密吸取丹葛酚酮膠囊(S5)供試品溶液、缺葛根陰性對(duì)照溶液、缺丹參陰性對(duì)照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，缺丹參和缺葛根陰性樣品在對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)明顯色譜峰，表明陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，該方法專屬性良好，如圖3所示。

2.7.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，以70%甲醇逐級(jí)稀釋成6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見(jiàn)表2)。

表2 各成分線性關(guān)系

2.7.3 精密度試驗(yàn)

取同一丹葛酚酮膠囊(S5)供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的RSD分別為0.53%、0.27%、0.82%、0.62%、0.45%、0.21%、0.20%、0.56%、0.16%(n=6)。表明儀器精密度好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一丹葛酚酮膠囊(S5)供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果顯示，3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的RSD分別為0.64%、0.49%、0.97%、0.71%、0.89%、0.32%、0.44%、0.75%、1.11%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一丹葛酚酮膠囊(S5)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定。結(jié)果顯示，3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均含量分別為25.65、167.78、38.20、49.48、39.04、170.93、6.68、3.68、9.69 mg/g，RSD分別為0.50%、0.56%、0.55%、0.84%、0.88%、0.53%、0.44%、0.63%、0.57%(n=6)。表明重復(fù)性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的丹葛酚酮膠囊(S5)樣品，每份約20 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共6份，分別精密加入對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，計(jì)算各成分的回收率及RSD值。3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率分別為97.28%、102.72%、100.44%、103.75%、98.46%、99.07%、101.60%、101.14%、101.00%，其RSD值分別為1.54%、1.22%、0.57%、1.40%、1.26%、1.43%、2.38%、1.30%、1.33%(n=6)，表明樣品的回收率良好(見(jiàn)表3)。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

成分Component樣品量Sample weight(mg)原有量Original amount(mg)加入量Added amount(mg)測(cè)得量Found amount(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Averge recovery(%) RSD(%)20.280.520 10.607 01.114 397.8819.790.507 60.607 01.085 095.13葛根素Puerarin19.713.306 93.732 57.189 2104.01102.721.2219.413.256 53.732 57.099 9102.9719.353.246 53.732 57.022 8101.1720.783.486 43.732 57.272 7101.4420.283.402 53.732 57.230 8102.5719.793.320 33.732 57.207 3104.143'-甲氧基葛根素3'-Methoxy puerarin 19.710.752 90.822 01.583 4101.03100.440.5719.410.741 50.822 01.563 7100.0319.350.739 20.822 01.560 699.9320.780.793 80.822 01.624 3101.0420.280.774 70.822 01.595 199.8019.790.756 00.822 01.584 4100.78葛根素芹菜糖苷Puerarin celery glycoside19.710.975 21.076 52.105 7105.01103.751.4019.410.960 41.076 52.050 7101.2819.350.957 41.076 52.063 6102.7620.781.028 21.076 52.150 5104.2620.281.003 41.076 52.125 4104.2219.790.979 21.076 52.109 0104.95大豆苷Daidzin19.710.769 50.938 41.711 3100.3598.461.2619.410.757 80.938 41.672 697.4819.350.755 50.938 41.669 997.4420.780.811 30.938 41.724 797.3320.280.791 80.938 41.720 598.9719.790.772 60.938 41.703 599.20丹酚酸BSalvianolic acid B19.713.369 13.525 66.893 099.9599.071.4319.413.317 83.525 66.867 7100.6919.353.307 63.525 66.738 997.3320.783.552 03.525 66.994 697.6520.283.466 53.525 66.943 198.6119.793.382 83.525 66.916 3100.23隱丹參酮Cryptotanshinone19.710.131 70.141 00.277 7103.55101.602.3819.410.129 70.141 00.276 4104.0719.350.129 30.141 00.266 697.3620.780.138 90.141 00.282 4101.8520.280.135 50.141 00.277 3100.6019.790.132 20.141 00.276 3102.18丹參酮ITanshinone I19.710.072 50.074 90.148 2101.07101.141.30

續(xù)表3(Continued Tab.3)

成分Component樣品量Sample weight(mg)原有量Original amount(mg)加入量Added amount(mg)測(cè)得量Found amount(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Averge recovery(%) RSD(%)19.410.071 40.074 90.148 1102.4519.350.071 10.074 90.146 099.9120.780.076 40.074 90.151 199.7420.280.074 60.074 90.150 0100.7319.790.072 80.074 90.149 9102.95丹參酮ⅡATanshinone IIA19.710.190 90.203 40.396 2100.93101.001.3319.410.188 00.203 40.396 9102.7119.350.187 40.203 40.390 299.6820.780.201 30.203 40.404 699.9820.280.196 40.203 40.400 1100.1319.790.191 70.203 40.400 4102.59

2.8 樣品含量測(cè)定

取10批丹葛酚酮膠囊樣品(S1～S10)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，計(jì)算樣品中3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-0.4%乙酸、乙腈-0.4%乙酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，乙腈-0.05%甲酸系統(tǒng)的分離效果最好，各色譜峰峰形較好，基本達(dá)到基線分離。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

為了使各特征峰均具有較好的響應(yīng)，比較了不同檢測(cè)波長(zhǎng)(250、270、275、280 nm)下各色譜峰的峰形和分離度，結(jié)果顯示，280 nm處各指標(biāo)性成分峰形較好，響應(yīng)值較高，分離度理想。

3.3 提取條件選擇

比較了不同提取溶劑(80%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、甲醇、30%乙醇)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明，70%甲醇的提取效果優(yōu)于其他提取溶劑，此時(shí)丹葛酚酮膠囊中各待測(cè)成分含量最高。

3.4 丹葛酚酮膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)

指紋圖譜能夠全面地反映丹葛酚酮膠囊中多種成分的有無(wú)及成分間比例的相似程度[13]，相對(duì)于指紋圖譜反映的“宏觀”特征，對(duì)有效成分的含量控制即屬于“細(xì)化”指標(biāo)，反映了發(fā)揮藥效作用的化學(xué)成分的直觀含量[14]。10批樣品的指紋圖譜相似度均大于0.99，表明本品固定了藥材基源和產(chǎn)地，原料質(zhì)量和成品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，因此，樣品間質(zhì)量有較好的一致性；含量測(cè)定結(jié)果顯示，成品中有效成分的種類(lèi)相對(duì)穩(wěn)定，但其含量受不同批次間藥材及成品收率差異的影響，從而存在一定的差異，這也提示了“指紋圖譜聯(lián)合多成分含量測(cè)定”對(duì)其質(zhì)量控制的必要性和全面性[14]。本實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜標(biāo)定了28個(gè)共有峰，可對(duì)樣品中的丹參和葛根進(jìn)行整體特征識(shí)別，定量方法可對(duì)9種主要有效成分含量進(jìn)行分析，能分別從定性與定量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)丹葛酚酮膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制。