王鵬旭,成傳香,賈 蒙,馬亞琴
西南大學(xué)柑桔研究所 國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶 400712
近年來(lái),隨著環(huán)境友好型理念的發(fā)展,食品、醫(yī)藥、生物、化工、化妝品等行業(yè)一直在探尋安全、高效的提取方法。在此期間,天然產(chǎn)物的“綠色提取”理念應(yīng)運(yùn)而生并逐漸走入大眾視野[1,2],其原則是通過(guò)對(duì)提取過(guò)程的重新設(shè)計(jì)優(yōu)化盡可能使提取產(chǎn)量最大化,提取過(guò)程清潔化、單元操作最小化,提取產(chǎn)物優(yōu)質(zhì)化以及環(huán)境污染最小化[1,3]。新興發(fā)展起來(lái)的提取技術(shù)包括超聲波輔助提取技術(shù)[4],微波輔助提取技術(shù)[5]、超臨界二氧化碳提取技術(shù)[6]、瞬時(shí)控制壓差技術(shù)[7]及這些技術(shù)的結(jié)合使用[8],可以較好克服傳統(tǒng)提取行業(yè)耗能高、耗時(shí)長(zhǎng)、污染大、效率低等弊端[9]。超聲波輔助提取技術(shù)又由于操作簡(jiǎn)單、用途廣泛、投資成本低等優(yōu)勢(shì),不斷被廣泛探究?jī)?yōu)化。
目前,超聲波提取設(shè)備主要以水浴式為主[10],即超聲發(fā)射器先傳遞能量進(jìn)入溶液后再進(jìn)入提取容器,此類超聲波提取設(shè)備的能量耗散較為嚴(yán)重,而且提取效率相對(duì)較低。探頭式超聲設(shè)備其探頭直接與物料接觸,誘導(dǎo)的大量的空化氣泡相當(dāng)于無(wú)數(shù)個(gè)小型壓榨機(jī),能有效的瓦解固體物料及細(xì)胞組織,促進(jìn)溶劑滲透、內(nèi)容物的釋放以及傳質(zhì)擴(kuò)散過(guò)程。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)已有將探頭式超聲波與動(dòng)態(tài)提取相結(jié)合,初步實(shí)現(xiàn)設(shè)備的中試運(yùn)行[10]。此外,傳統(tǒng)提取行業(yè)由于有機(jī)溶劑的使用,使得提取產(chǎn)物中不可避免地殘留有機(jī)溶劑影響其品質(zhì),尤其是在精細(xì)化工行業(yè)以及制藥行業(yè),其品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著人體健康?!熬G色提取”理念則強(qiáng)調(diào)以水或臨界水或其他安全無(wú)毒的替代溶劑包括超超臨界二氧化碳、甘油、檸檬烯、低共熔溶劑、離子液體等[11-13]。
響應(yīng)曲面法可以通過(guò)對(duì)多個(gè)變量進(jìn)行試驗(yàn)、建模、驗(yàn)證擬合出變量與響應(yīng)之間的函數(shù),在各領(lǐng)域的工藝優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用[14]。由于RSM的優(yōu)化結(jié)果可進(jìn)行可視化分析,因此便于解讀各個(gè)參數(shù)對(duì)多酚產(chǎn)量的影響特征。GA-ANN具有很好的自我學(xué)習(xí)能力,GA可以對(duì)測(cè)試誤差計(jì)算適應(yīng)度,使誤差的精度控制在盡可能小的范圍,使ANN的預(yù)測(cè)結(jié)果更加符合期望值,具有很強(qiáng)的魯棒性及全局尋優(yōu)性。因此,本文欲將RSM與GA-ANN聯(lián)用,對(duì)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)輔助水提取橙皮多酚的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,為天然產(chǎn)物的綠色提取提供理論依據(jù)及方案支撐。
橙皮、蒸餾水,來(lái)自加工中試車間;Folin-酚試劑,重慶鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;沒食子酸,成都化夏化學(xué)試劑有限公司;碳酸鈉,重慶川東化工集團(tuán)有限公司。
超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY98-IIIN)、恒溫水浴槽(SDC-6),寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司;紫外可見分光光度計(jì)(TU-1901),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M),長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限責(zé)任公司;漩渦震蕩器(XW-80A),海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
1.3.1 材料預(yù)處理
將來(lái)自于加工中試車間的橙皮在烘干箱中40 ℃恒溫干燥72 h,然后用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩(微粒尺寸約0.3 mm),密封包裝放置于-18 ℃冰箱中保存。
1.3.2 提取程序
取一定量的橙皮粉于定制的夾層反應(yīng)器中,反應(yīng)器外接循環(huán)水以控制反應(yīng)溫度,將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)探頭插入反應(yīng)器內(nèi)。選擇適合200 mL左右樣品量的直徑為15 mm的探頭。探頭表面與液面之間的距離保持為20 mm。反應(yīng)器內(nèi)部插入熱電偶溫度計(jì),將實(shí)時(shí)溫度傳輸于控制面板以檢測(cè)溫度的動(dòng)態(tài)變化。占空比(0.1%~99.9%)可以根據(jù)需求調(diào)節(jié),頻率19.5~20.5 kHz,超聲功率120 W。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,由于超聲時(shí)間對(duì)提取產(chǎn)量的影響較為有限,因此選擇超聲時(shí)間為5 min。超聲結(jié)束后,取出反應(yīng)液于4 ℃離心機(jī)離心,收集上清液并測(cè)定吸光度。對(duì)照組采用超聲波輔助80%甲醇水溶液提取多酚,其總酚含量為9.67 mg GAE/g。
1.3.3 總酚測(cè)定
總酚測(cè)定參照Singleton等[15]并稍有改動(dòng)。取處理后的提取液0.5 mL于25 mL比色試管中并置于暗處,待測(cè)試時(shí)用水稀釋至10 mL刻度線,搖晃均勻后加入Folin-酚試劑1 mL,并漩渦震蕩1 min,放在避光處?kù)o置5 min,然后再加入5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的碳酸鈉溶液并用蒸餾水定容至25 mL,放在避光處反應(yīng)30 min,在760 nm處測(cè)定其吸光度。標(biāo)曲的制作:標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸,母液濃度為2 mg/mL。分別吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL的母液于比色試管中按上述步驟測(cè)定吸光度??偡雍恳悦靠烁沙绕ぶ械臎]食子酸當(dāng)量表示(mg gallic acid equivalent/g)(mg GAE/g)。
滾筒直徑應(yīng)適中,過(guò)大則整體結(jié)構(gòu)及料箱高度隨之增大,且滑板伸出長(zhǎng)度變短出料效果差;過(guò)小則滑板伸出長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng),轉(zhuǎn)速高,經(jīng)過(guò)料箱時(shí)槽內(nèi)充料時(shí)間縮短,充料不可靠。滾筒的外圓線速度與穴盤的速度應(yīng)相等,即它們的相對(duì)速度為0。本設(shè)計(jì)中取滾筒旋轉(zhuǎn)7/8轉(zhuǎn)覆料1盤,直徑為196mm。
1.3.4 工藝參數(shù)篩選
選取溫度、占空比、料液比為目標(biāo)參數(shù),各個(gè)參數(shù)的考察水平分別為超聲溫度(25、40、55、70 ℃),占空比(1/3、1/2、2/2、2/1),料液比(1/100、1/50、1/33、1/25、1/20 g/mL)。
1.3.5 RSM設(shè)計(jì)
在篩選后的工藝參數(shù)基礎(chǔ)上,以總酚含量為響應(yīng)值,通過(guò)Box-Benhnken(BBD)并結(jié)合RSM對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。其具體因素與水平設(shè)計(jì)如下表1:
表1 BBD因素與水平編碼
1.3.6 GA-ANN模型構(gòu)建優(yōu)化
本研究采用多層前饋人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),ANN模型3層,以溫度、占空比、料液比作為輸入層神經(jīng)元,隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)由(1)計(jì)算得出。本研究輸入層神經(jīng)元為4個(gè),輸出層神經(jīng)元1個(gè),因此隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為2+c,構(gòu)建出的神經(jīng)元拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致如下圖1。
(1)
式中:h表示隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù);i表示輸入層神經(jīng)元個(gè)數(shù);o表示輸出層神經(jīng)元個(gè)數(shù);c表示常數(shù),其取值范圍為1≤c≤10。
圖1 ANN的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig.1 Topological Structure of ANN
采用Levenberg-Marquardt算法作為訓(xùn)練函數(shù)。同時(shí),隱含層激勵(lì)函數(shù)為tansig,輸出層激勵(lì)函數(shù)為purelin,學(xué)習(xí)次數(shù)為2 000,學(xué)習(xí)率為0.1,學(xué)習(xí)目標(biāo)為0.000 1。GA優(yōu)化參數(shù)為個(gè)體數(shù)目10,最大遺傳代數(shù)100,交叉概率0.7,變異概率0.05。
采用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析(ANOVA)及其顯著性分析,P<0.05表明差異顯著;采用Origin 2017繪圖;RSM優(yōu)化采用Design-expert 8.0;ANN模型的構(gòu)建與GA優(yōu)化采用Matlab R2017b。模型的評(píng)價(jià)采用均方誤差(root mean square error,RMSE)、平均絕對(duì)誤差(mean absolute error,MAE)、決定系數(shù)(R2)三個(gè)指標(biāo)。RMSE和MAE越小,R2越大,表示模型越好。
(2)
(3)
(4)
式中:Yp表示預(yù)測(cè)值;Ya表示實(shí)際值;Ya表示實(shí)際值的平均值。
超聲溫度會(huì)影響溶質(zhì)的傳質(zhì)過(guò)程,同時(shí)還會(huì)影響空化氣泡的數(shù)量以及崩塌強(qiáng)度,從而影響提取產(chǎn)量。在占空比2/2,料液比1∶25 g/mL時(shí)。由圖2可以看到,總酚含量隨著溫度的增加呈先減少后增加的趨勢(shì),在40 ℃時(shí),其總酚含量最低。這可能是由于隨著溫度的增加,個(gè)別多酚類物質(zhì)發(fā)生了一定程度的降解,同時(shí)由于是以水為介質(zhì),較低溫度下空化氣泡崩塌誘導(dǎo)水分子均裂產(chǎn)生的羥基自由基較多,攻擊了溶液中的酚類化合物單體,導(dǎo)致其表觀提取產(chǎn)量下降[16]。但是隨著溫度的再次增加(55和70 ℃)可能促進(jìn)了傳質(zhì)過(guò)程,使得酚類化合物產(chǎn)量再次提升。因此,綜合考慮,選擇40、55、70 ℃作為RSM的考察對(duì)象。
圖2 溫度對(duì)總酚含量的影響Fig.2 The effects of temperature on total phenolic content
占空比(超聲開啟時(shí)間/(超聲開啟時(shí)間+超聲停止時(shí)間))是超聲波細(xì)胞破粉碎機(jī)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù),可以根據(jù)物料的質(zhì)地適當(dāng)調(diào)節(jié)占空比以達(dá)到較好的提取效果。在溫度40 ℃,料液比1∶25 g/mL時(shí),圖3展示了占空比對(duì)總酚含量的影響。隨著占空比(超聲開啟時(shí)間)的增加,總酚含量呈先增加后減少的趨勢(shì),在占空比1/2情況下,其提取產(chǎn)量達(dá)到最大值為8.07 mg GAE/g。隨著占空比繼續(xù)的增加,總酚含量顯著降低,在2/1占空比下,總酚含量為6.69 mg GAE/g,相比占空比1/2時(shí)減少了17.1%。這充分說(shuō)明占空比對(duì)多酚的提取具有顯著影響。占空比越高,直接作用于介質(zhì)的有效時(shí)間越長(zhǎng),誘導(dǎo)的空化氣泡越多,羥基自由基的產(chǎn)量也越高,雖然能有效瓦解物料組織,但是也容易造成多酚結(jié)構(gòu)的破壞。同時(shí),在工業(yè)上,較低占空比的使用有助于節(jié)省成本[17]。因此,選擇占空比1/3、1/2、2/2作為RSM的優(yōu)化對(duì)象。
圖3 占空比對(duì)總酚含量的影響Fig.3 The effects of duty cycle on total phenolic content
料液比的選擇直接影響提取產(chǎn)量,同時(shí)又是工業(yè)化生產(chǎn)較為重視的參數(shù)之一。在超聲溫度40 ℃,占空比2/2條件下,圖4展示了料液比對(duì)總酚含量的影響。隨著料液比的增加,總酚含量呈線性增加,料液比為1∶20 g/mL時(shí),總酚含量為8.75 mg GAE/g,相比1∶100 g/mL時(shí)的2.46 mg GAE/g,產(chǎn)量增加近乎2.6倍。這些結(jié)果說(shuō)明在超聲參數(shù)固定情況下,其釋放的能量較為強(qiáng)大,在料液比大幅度增加時(shí),其能量還可以有效破碎物料組織結(jié)構(gòu)。但是在探究中發(fā)現(xiàn),料液比為1∶20 g/mL時(shí),由于溶液介質(zhì)濃度過(guò)高,造成超聲探頭發(fā)熱嚴(yán)重,釋放的熱量在短時(shí)間內(nèi)局部積累過(guò)高,這對(duì)于多酚的提取以及探頭都是不利的。因此,選擇料液比1∶50、1∶33、1∶25 g/mL作為RSM的優(yōu)化對(duì)象。
圖4 料液比對(duì)總酚含量的影響Fig.4 The effects of solid-liquid ratio on total phenolic content
2.2.1 模型建立及分析
天然產(chǎn)物提取的一個(gè)重要目標(biāo)就是盡可能使提取產(chǎn)量最大化并減小對(duì)目標(biāo)提取物的影響,同時(shí)避免不理想的降解產(chǎn)物的發(fā)生[18]。由單因素實(shí)驗(yàn)可以明顯看出,較短時(shí)間(5 min),較高溫度,較低占空比和較高料液比是有助于橙皮多酚的提取,這說(shuō)明各工藝參數(shù)之間可能存在交互作用。尋求最優(yōu)工藝參數(shù),是工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。因此以溫度(A)、占空比(B)、料液比(C)為自變量,以總酚含量(Y)為響應(yīng)值,建立了回歸模型,其方程如下:Y=4.882 41-0.150 31A-5.956 74B+230.225 5C+0.102 94AB+0.167 15AC+5.776 96BC+0.001 645 1A2-0.528 5B2-1 015.466 62C2。
通過(guò)對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析,如表2所示,P<0.000 1,表明擬合出的模型具有高度顯著性,說(shuō)明模型可以很好的預(yù)測(cè)總酚的提取產(chǎn)量。失擬項(xiàng)=0.051 8>0.05,表明所選取的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)能用擬合出的函數(shù)表示。決定系數(shù)R2=0.999 2,表明回歸方程對(duì)結(jié)果預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度很高。同時(shí),從表2顯著性檢驗(yàn)一欄可以看到各因素對(duì)總酚含量的影響程度,溫度(A)(P<0.000 1)、料液比(C)(P<0.000 1)、溫度與占空比的交互作用(AB)(P=0.000 2)對(duì)結(jié)果都有極顯著的影響。溫度的平方(P<0.000 1)對(duì)結(jié)果也有極顯著影響。占空比(B)和料液比平方(C2)(P<0.005)對(duì)結(jié)果有顯著影響。各工藝參數(shù)對(duì)總酚產(chǎn)量的影響順序?yàn)锳>C>B,即溫度>料液比>占空比。
2.2.2 交互作用分析
根據(jù)表2以及圖5可以看到,占空比與溫度的交互作用對(duì)提取產(chǎn)量有顯著性影響,在較低溫度下(40 ℃),占空比對(duì)酚類化合物的提取幾乎呈負(fù)面影響,這與之前的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合,說(shuō)明超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)在以水為介質(zhì),低溫度高占空比情況下,短時(shí)間內(nèi)就可以造成所提取出的酚類化合物發(fā)生降解。同時(shí)也說(shuō)明以水為介質(zhì)情況下,超聲波的聲化學(xué)效應(yīng)是不能被忽略的。Patil等[19]用探頭式超聲波設(shè)備提取喜樹堿時(shí)發(fā)現(xiàn)高占空會(huì)導(dǎo)致提取產(chǎn)量發(fā)生顯著下降。但是,在較高溫度下,占空比對(duì)酚類化合物的影響似乎不再顯著。從圖中5(I)可以看出,在溫度(70 ℃)與占空比(2/2)都較高情況下,橙皮多酚的提取產(chǎn)量明顯增加,其曲面由平緩逐漸變得陡峭。這可能是在此過(guò)程中,雖然高占空比也造成酚類化合物的降解,但是溫度的增加提升了傳質(zhì)過(guò)程,促進(jìn)了內(nèi)容物的釋放。同時(shí),溫度的增加使得溶液粘度和表面張力減小,蒸汽壓力升高,造成更多的蒸汽進(jìn)入空化氣泡,使得空化氣泡的崩塌強(qiáng)度衰減,羥基自由基的產(chǎn)量降低,一定程度上限制了酚類化合物發(fā)生降解[20]。料液比與溫度(圖5 II)、料液比與占空比(圖5 III)之間的交互作用均不顯著,從圖中可以看出,其曲面近乎呈平滑斜面,說(shuō)明料液比對(duì)提取產(chǎn)量的影響過(guò)于顯著,使得溫度與占空比對(duì)提取產(chǎn)量的影響在短時(shí)間內(nèi)可以忽略不計(jì)。
表2 RSM優(yōu)化模型的方差分析表
注:*P<0.05,**P<0.01。
Note:*P<0.05,**P<0.01.
圖5 操作參數(shù)對(duì)總酚含量的交互作用Fig.5 Interaction of operating parameters on total phenolic content注:A:溫度;B:占空比;C:料液比。Note:A:Temperature;B:Duty cycle;C:Solid-liquid ratio.
2.2.3 模型驗(yàn)證
通過(guò)對(duì)RSM優(yōu)化出的工藝參數(shù)(溫度68.60 ℃、占空比2/2、料液比1∶25 g/mL)進(jìn)行模型驗(yàn)證,結(jié)果顯示,以水為溶劑并在該工藝參數(shù)下,總酚含量為8.18 mg GAE/g,較Khan等[21]用80%乙醇從橙皮中回收的總酚含量2.78 mg GAE/g相比,絕對(duì)提取量為5.4 mg GAE/g,提取率接近其3倍,表明此種提取方法的高效性以及水提取的可行性。
2.3.1 隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)的確定
由于隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)會(huì)影響輸出結(jié)果的精度,因此初步確定3、4、5、6為隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)。訓(xùn)練樣本為RSM數(shù)據(jù)中的75%,驗(yàn)證樣本為15%,測(cè)試樣本為15%,分別計(jì)算對(duì)比擬合精度,進(jìn)一步確定隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)。從圖6可以看出,隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為3時(shí),模型擬合效果最好。
2.3.2 RSM與GA-ANN模型優(yōu)化結(jié)果及其分析
從圖7可以看出,在經(jīng)過(guò)60代進(jìn)化后,其適應(yīng)度已達(dá)到最大值,此時(shí)對(duì)應(yīng)的工藝參數(shù)為溫度67.546 5 ℃,占空比0.394 0,料液比0.039 8,預(yù)測(cè)的最優(yōu)產(chǎn)量為8.402 0 mg GAE/g,根據(jù)實(shí)際將工藝參數(shù)調(diào)整為溫度67 ℃,占空比1/2,料液比1∶25 g/mL。從表3與表4可以看出,相較于RSM,GA-ANN的RMSE與MAE均小于RSM,但是GA-ANN(0.997 9)的決定系數(shù)R2要小于RSM(0.999 2)。對(duì)比其預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相對(duì)誤差,GA-ANN的準(zhǔn)確度要高于RSM。超聲輔助80%甲醇水溶液提取的總酚含量為9.67 mg GAE/g,在此優(yōu)化的條件下,水提取的總酚含量為8.21 mg GAE/g,達(dá)到其84%的產(chǎn)量,證明用GA-ANN優(yōu)化工藝參數(shù)的可行性。
圖6 不同隱含層數(shù)的回歸圖Fig.6 Regression map with different hidden layers注:A:隱含層= 3;B:隱含層=4;C:隱含層=5;D:隱含層=6;Note:A:Hidden layer=3;B:Hidden layer=4;C:Hidden layer=5;D:Hidden layer=6.
隨著綠色發(fā)展理念和可持續(xù)發(fā)展理念的貫徹以及消費(fèi)者對(duì)綠色產(chǎn)品的需求,綠色提取技術(shù)會(huì)步入新的發(fā)展階段,天然產(chǎn)物的綠色提取是基于對(duì)提取過(guò)程的重新設(shè)計(jì),從而減少能源消耗以及有機(jī)溶劑的使用,確保提取物的品質(zhì)和安全。因此,開發(fā)節(jié)能高效的提取過(guò)程和安全環(huán)保的提取技術(shù)就顯得尤為重要。綠色溶劑的開發(fā)選用及其配套設(shè)備的研發(fā)是實(shí)現(xiàn)綠色提取的重要環(huán)節(jié)。水作為最環(huán)保的溶劑,如何用水提取使天然產(chǎn)物的產(chǎn)量最大化也是重要的研究課題。本研究將超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)與水結(jié)合提取多酚,實(shí)現(xiàn)了良好的結(jié)果。相較于以80%甲醇水溶液為溶劑,水提取的產(chǎn)量達(dá)到了84%的比例。但是,需要注意的是,在提取過(guò)程中占空比和料液比的選用至關(guān)重要。較高的占空比會(huì)造成多酚類物質(zhì)發(fā)生降解,過(guò)高的料液比則會(huì)造成料液內(nèi)部局部溫度過(guò)高,影響探頭使用壽命以及多酚穩(wěn)定性。
圖7 適應(yīng)度曲線Fig.7 Fitness curve
表3 模型評(píng)價(jià)
表4 RSM與GA-ANN優(yōu)化結(jié)果對(duì)比及評(píng)價(jià)
RSM與GA-ANN聯(lián)用優(yōu)化的條件為:溫度67 ℃,占空比1/2,料液比1∶25 g/mL,總酚含量為8.21 mg GAE/g,顯著降低了預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間的相對(duì)誤差。因此,RSM與GA-ANN聯(lián)用具有更優(yōu)越的全局尋優(yōu)能力。同時(shí),本研究也證明了超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)輔助水提取多酚的可行性,為天然產(chǎn)物綠色提取的實(shí)驗(yàn)室探索、中試優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。