靈芝菌絲體富硒條件優(yōu)化及其硒多糖抗氧化活性研究

金 鑫，熊 川，黃文麗，陳祖琴，李 萍，張 利，朱 宇*

1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，成都 610061；2阿壩州林業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，汶川 623000

靈芝是我國(guó)一種重要的傳統(tǒng)食藥用真菌，具有廣泛的藥理活性，已被大量研究證明其具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等功效[1-6]，而發(fā)揮這些功效的主要成分為靈芝多糖。硒是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，抵抗有關(guān)疾病的發(fā)生，然而硒不能由機(jī)體自主合成，只能從體外攝取，人體攝入的有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖[7]。大量的研究表明靈芝具有較強(qiáng)的富硒能力[8,9]，靈芝菌絲體通過(guò)富硒發(fā)酵培養(yǎng)，將靈芝多糖與人體必需微量元素硒進(jìn)行一定程度的螯合，進(jìn)而結(jié)合成為靈芝多糖有機(jī)硒化合物，從而更容易被人體吸收[10,11]，以達(dá)到二者共同促進(jìn)的作用，對(duì)人體健康具有重要保健作用。富硒發(fā)酵培養(yǎng)是將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的有效方法之一，從營(yíng)養(yǎng)學(xué)和微生物代謝角度考慮，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化作用得到的靈芝富硒多糖，具有生物利用率高、生理藥理功效更優(yōu)、安全、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，因此，富硒靈芝的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以美國(guó)大靈芝(Ganodermaoregonense)作為載體，無(wú)機(jī)硒亞硒酸鈉作為硒源，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源和亞硒酸鈉濃度進(jìn)行微生物富硒發(fā)酵，并在富硒發(fā)酵過(guò)程中初步探析發(fā)酵液胞外酶活性變化，最后提取菌絲體硒多糖，研究其抗氧化活性。本研究獲得的硒多糖將靈芝與硒功效融合于一體，發(fā)揮了硒和靈芝固有的以及協(xié)同的生理作用，具有極大的食用價(jià)值，為富硒靈芝產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

2 材料方法

1.1 材料

美國(guó)大靈芝(G.oregonense)菌株由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室保存。馬鈴薯、玉米粉、麩皮，市購(gòu)；亞硒酸鈉、葡萄糖、瓊脂粉、H2SO4、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇、Tris-HCl、DPPH、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵銨、Vc、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、NaOH、水楊酸、HCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝菌株的提純和復(fù)壯[12]

靈芝提純培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)，土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、玉米粉10 g、麩皮50 g、青岡樹皮100 g。水1 000 mL，pH自然。靈芝復(fù)壯培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、玉米粉10 g、麩皮50 g、青岡樹皮100 g、干靈芝子實(shí)體50 g。水1 000 mL，pH自然，分別制作斜面試管和平板。

將實(shí)驗(yàn)室保存的靈芝菌種用接種鉤接入提純培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)斜面菌絲生長(zhǎng)到一半后，挑選生長(zhǎng)快而健壯的試管，取菌絲的尖端部位菌絲體移接到復(fù)壯培養(yǎng)基中，同樣28 ℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)復(fù)壯培養(yǎng)基中斜面菌絲生長(zhǎng)到一半后，挑選生長(zhǎng)快而健壯的試管，取菌絲的尖端部位菌絲體移接到復(fù)壯培養(yǎng)基的平板中間，28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿待用。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)正交試驗(yàn)

發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm[13,14]。分別以葡萄糖、馬鈴薯、可溶性淀粉為A變量；蛋白胨、玉米粉、麩皮為B變量；5、10、15 mg/L的Na2SeO3為C變量。選定適當(dāng)水平，設(shè)計(jì)L9(33)進(jìn)行正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以生物量、硒含量、富硒率為指標(biāo)，對(duì)富硒靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)原料進(jìn)行優(yōu)化。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，250 mL容量錐形瓶每瓶裝培養(yǎng)基150 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，每瓶接種3塊直徑5 mm的靈芝菌種，然后置于28 ℃恒溫振蕩箱中，以180 rpm 轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)15天。

表1 因素水平表

1.2.3 生物量測(cè)定

參考Jiang[15]，并做適當(dāng)修改，在培養(yǎng)的第15天，將靈芝菌絲發(fā)酵液經(jīng)5 000 rpm離心10 min，去除上清液，菌絲體用去離子水震蕩洗滌后再離心去上清液，重復(fù)操作，直至上清液不再帶有發(fā)酵液顏色為止，收集菌體，置于烘箱內(nèi)45 ℃烘干至恒重。以菌絲得率代表生物量，計(jì)算公式如下：生物量(g/L)=[(菌絲干重/g)/(發(fā)酵液體積/mL)]×1 000。

1.2.4 菌絲體硒含量測(cè)定

菌絲體硒含量測(cè)定參照GB 5009.93-2017中電感耦合等離子體質(zhì)譜法。富硒率(%)=(菌絲體硒含量×菌絲體干重)/培養(yǎng)基中所添加硒量。

1.2.5 菌絲體胞外酶活性測(cè)定

在液體培養(yǎng)開始的第3天開始每隔2天吸取發(fā)酵液5 mL，在4 ℃下5 000 rpm離心10 min，得上清液即為粗酶液，連續(xù)測(cè)定5次。過(guò)氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的方法測(cè)定酶活性。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2.6 菌絲體粗多糖含量測(cè)定

熱水浸提法提取菌絲體粗多糖：稱取冷凍干燥粉碎后的靈芝菌絲體樣品5 g，加入90 mL的去離子水，置于250 mL錐形瓶中，在90 ℃的水浴鍋中恒溫水浴180 min，5 000 rpm離心10 min后，留下上清液，殘?jiān)貜?fù)浸提1次，離心后，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20 mL下，加3倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，4 ℃靜置過(guò)夜，沉淀物用無(wú)水乙醇洗2次后，置于45 ℃烘箱中烘至恒重，即得粗多糖。粗多糖得率=(粗多糖質(zhì)量/菌絲體質(zhì)量)×100%。將粗多糖用無(wú)菌蒸餾水配制成1 mg/mL的樣品溶液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[16]。

1.2.7 粗多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2007 軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 靈芝菌絲體富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)

生物量是反映靈芝菌絲生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)，硒含量是反映靈芝菌絲對(duì)硒的吸收能力，富硒率是反映靈芝菌絲吸收的硒總量與培養(yǎng)基中添加的亞硒酸鈉中的硒總量之比，表2是正交試驗(yàn)的結(jié)果，并以富硒率計(jì)算極值，從表2中可以看出，在碳源因素水平上分析，其(K2與(K1和(K3之間存在顯著差異(P<0.05)，(K2最優(yōu)；從氮源因素水平上看，其(K3與(K1和(K2之間存在顯著差異(P<0.05)，(K3最優(yōu)；從Na2SeO3濃度水平因素上看，其(K1與(K2和(K3之間存在明顯顯著差異(P<0.05)，(K1最優(yōu)。因此，試驗(yàn)優(yōu)化得到的靈芝菌絲體富硒培養(yǎng)條件方案為：A2B3C1，即培養(yǎng)基中優(yōu)選20%馬鈴薯，2%麩皮，濃度為5 mg/L Na2SeO3，該試驗(yàn)組生物量最大為3.86 g/L，硒含量也最高為0.576 mg/g，富硒率同樣最高為44.47%。

從圖1中可以看出，靈芝菌絲體的生長(zhǎng)性狀存在一定的差異，第1組、第8組、第6組，其Na2SeO3濃度為5 mg/L時(shí)發(fā)酵液菌絲球顏色為白色，菌絲球數(shù)量較少，但直徑較大；第2組、第4組、第9組，其Na2SeO3濃度為10 mg/L時(shí)，其菌絲球邊緣顏色為白色，里面則帶著淺紅色，細(xì)小菌絲球較多；第3組、第5組、第7組，其Na2SeO3濃度為15 mg/L時(shí)，其細(xì)小菌絲球邊緣顏色為白色，但直徑較大點(diǎn)的菌絲球變?yōu)樯罴t色，可見(jiàn)，隨著Na2SeO3濃度的增加，菌絲球顏色逐漸加深，Na2SeO3對(duì)菌絲的影響程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于碳源和氮源的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2(Continued Tab.2)

組別Group因素FactorABC生物量Biomass (g/L)硒含量Selenium content (mg/g)富硒率Selenium enrichment rate (%)83213.20±0.05b0.542±0.001a34.6993322.79±0.01c0.465±0.001b12.97(K117.40b16.87b37.64a(K220.37a17.14b12.38b(K317.49b21.25a4.25c極差Range8.9313.15100.16

注：不同小寫字母表示不同組間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters showed significant differences among different groups (P<0.05),the same below.

圖1 靈芝菌絲體生長(zhǎng)試驗(yàn)Fig.1 G.oregonense mycelium growth test

2.2 胞外過(guò)氧化物酶活性分析

過(guò)氧化物酶是靈芝體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高低與酚類物質(zhì)代謝和植物抗性密切相關(guān)，測(cè)定靈芝發(fā)酵液內(nèi)過(guò)氧化物酶活性一定程度上能反映其在特定環(huán)境下的適應(yīng)能力。通過(guò)對(duì)9組試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)氧化物酶活性測(cè)定(見(jiàn)圖2)，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶活性處在1.26～12.74 U/mL之間，其中第6組、第8組、第1組其酶活性顯著高于其他組，在培養(yǎng)9天之前，其酶活性都是處于顯著升高態(tài)勢(shì)，第9天到第12天處于緩慢上升中，在第12天到第15天酶活性則處于下降趨勢(shì)，這三組都為添加5 mg/L濃度的Na2SeO3組。第7組、第2組和第4組，其酶活性在培養(yǎng)第3天到第9天處于緩慢上升中，在第9天到12天其上升趨勢(shì)則變大，在第12天到第15天，其酶活性又緩慢下降，該三組中，第7組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3組，第2組和第4組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3組；第9組、第3組和第5組在培養(yǎng)第3天到第15天之間其酶活性整體變化趨勢(shì)不大，呈現(xiàn)小幅度的先上升后降低，酶活性較明顯低于其他組，該三組中，第9組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3組，第3組和第5組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3組。通過(guò)過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Na2SeO3濃度對(duì)酶活性的影響明顯大于碳源和氮源，該酶活性變化趨勢(shì)同菌絲生長(zhǎng)量、富硒率相同。

圖2 靈芝菌絲體發(fā)酵液POD酶活性變化Fig.2 Changes in POD enzyme activity in G.oregonense mycelium fermentation broth

2.3 胞外多酚氧化酶活性分析

PPO是含有銅離子的膜蛋白酶，能導(dǎo)致褐色素的生成，是導(dǎo)致多種食用菌、果蔬損傷后褐變的主要酶類，通過(guò)對(duì)9組試驗(yàn)進(jìn)行多酚氧化酶活性測(cè)定(見(jiàn)圖3)，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶活性處在1.57～13.06 U/mL之間。第1組、第6組、第8組都為添加5 mg/L濃度的Na2SeO3，其酶活性顯著高于其他組，在培養(yǎng)12天之前，其酶活性都是處于顯著升高態(tài)勢(shì)，其中第6組呈直線上升，在第12天達(dá)到最大值13.06 U/mL，三組試驗(yàn)在第12天到第15天則處于下降趨勢(shì)，總體變化趨勢(shì)同過(guò)氧化物酶活性變化趨勢(shì)相同；第2組、第4組、第5組和第3組，其酶活性在培養(yǎng)第3天到第12天都處于緩慢上升中，在第12天到第15天，其酶活性又緩慢下降，該四組中，第4組和第2組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3，第5組和第3組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3，可見(jiàn)Na2SeO3濃度從5 mg/L提高到10 mg/L時(shí)，其酶活性變化較大，明顯受到抑制，在Na2SeO3濃度從10 mg/L提高到15 mg/L時(shí)，其酶活性變化較??；第9組和第7組試驗(yàn)在培養(yǎng)第3天到第9天之間其酶活性整體變化趨勢(shì)較小，呈現(xiàn)小幅度的上升，從培養(yǎng)第9天到第15天，其酶活性變化則逐漸降低，第9組為添加10 mg/L濃度的Na2SeO3，第7組為添加15 mg/L濃度的Na2SeO3。通過(guò)多酚氧化酶活性的測(cè)定，同樣發(fā)現(xiàn)Na2SeO3濃度對(duì)酶活性的影響明顯大于碳源和氮源，可見(jiàn)，在富硒條件優(yōu)化正交試驗(yàn)中，Na2SeO3濃度起到了主要的控制作用。

圖3 靈芝菌絲體發(fā)酵液PPO酶活性變化Fig.3 Changes in PPO enzyme activity in G.oregonense mycelium fermentation broth

2.4 多糖含量分析

對(duì)9組試驗(yàn)靈芝菌絲進(jìn)行粗多糖提取，結(jié)果見(jiàn)圖4，從圖中可以看出9組試驗(yàn)粗多糖含量位于2.29%～2.85%之間，含量最高的為第6組，最低的為9組。第1組、第2組、第6組和第8組之間多糖含量差異不顯著(P>0.05)，第3組、4組、5組和第7組之間多糖含量差異同樣不顯著(P>0.05)，第1～8組多糖含量同第9組存在顯著差異(P<0.05)?？梢?jiàn)，在富硒靈芝發(fā)酵的條件優(yōu)化正交試驗(yàn)中，碳源、氮源和Na2SeO3濃度對(duì)靈芝菌絲體內(nèi)的粗多糖含量影響不大，僅從粗多糖含量上難以區(qū)分9組試驗(yàn)的優(yōu)劣，必須對(duì)粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖4 靈芝菌絲體粗多糖含量比較Fig.4 Comparison of crude polysaccharide content in G.oregonense mycelium

2.5 不同組別靈芝菌絲粗多糖對(duì)DPPH的清除率

9組試驗(yàn)其粗多糖的DPPH清除率范圍在69.57%～87.25%之間，見(jiàn)圖5，而Vc的DPPH清除率達(dá)到96.93%，Vc陽(yáng)性對(duì)照與9組試驗(yàn)其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗(yàn)的DPPH清除率中，第1組、4組、6組、8組其清除率要高于其他組，且存在顯著差異(P<0.05)，這4組試驗(yàn)中，第1組、6組、8組分別為不同的碳源和氮源，難以篩選出最優(yōu)的碳源和氮源，但卻存在相同的Na2SeO3濃度，為5 mg/L，第4組Na2SeO3濃度為10 mg/L；第2組、第3組、第5組和第9組粗多糖對(duì)DPPH的清除率之間不存在顯著差異(P>0.05)，這四組中，第2組和第9組Na2SeO3濃度為10 mg/L，第3組和第5組Na2SeO3濃度15 mg/L，第7組的清除率最低，與其他組都存在顯著差異(P<0.05)，第7組Na2SeO3濃度為15 mg/L?？傮w上可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時(shí)，其試驗(yàn)組粗多糖的DPPH清除率明顯高于其他組，該結(jié)果同發(fā)酵液胞外酶活性趨勢(shì)相同。

圖5 不同組靈芝菌絲體粗多糖對(duì) DPPH 的清除能力Fig.5 DPPH scavenging capacity of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia

2.6 不同組別靈芝菌絲體粗多糖對(duì)超氧自由基清除能力比較

9組試驗(yàn)其粗多糖的超氧自由基清除率范圍在39.74%～68.58%之間，見(jiàn)圖6，最高的組別為第8組，最低組別為第3組，而Vc的超氧自由基清除率達(dá)到99.54%，Vc陽(yáng)性對(duì)照與9組試驗(yàn)其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗(yàn)的超氧自由基清除率中，第1組、6組、和8組其清除率要高于其他組，與其他組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗(yàn)中，分別為不同的碳源和氮源，其Na2SeO3濃度則相同，均為5 mg/L；第2組、第4組、第5組、第7組和第9組其粗多糖對(duì)超氧自由基的清除率，其相互之間不存在顯著差異(P>0.05)，這五組中，第2組、第4組和第9組其Na2SeO3濃度為10 mg/L，第5組和第7組Na2SeO3濃度15 mg/L。從9組試驗(yàn)中可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時(shí)，其試驗(yàn)組粗多糖的超氧自由基清除率明顯高于其他組，高濃度的Na2SeO3對(duì)粗多糖的抗氧化活性起到了抑制作用，該結(jié)果同DPPH清除率趨勢(shì)相同。

圖6 不同組靈芝菌絲體粗多糖對(duì)超氧自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia to superoxide free radicals

2.7 不同組別靈芝菌絲體粗多糖對(duì)羥自由基清除能力比較

9組試驗(yàn)其粗多糖的羥自由基清除率范圍在22.92%～52.62%之間，見(jiàn)圖7，最高的組別為第6組，最低組別為第3組，而Vc的羥自由基清除率達(dá)到95.28%，Vc陽(yáng)性對(duì)照與9組試驗(yàn)其清除率存在顯著差異(P<0.05)。在9組試驗(yàn)的羥自由基清除率中，第1組、6組、和8組其清除率要高于其他組，與其他組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗(yàn)中，分別為不同的碳源和氮源，其Na2SeO3濃度則相同，均為為5 mg/L；第2組、第4組、和第9組其粗多糖對(duì)羥自由基的清除率，其相互之間不存在顯著差異(P>0.05)，這三組中，第2組、第4組和第9組其Na2SeO3濃度為10 mg/L；第5組和第7組羥自由基清除率不存在顯著差異(P>0.05)，但與第3組存在顯著差異(P<0.05)，這三組試驗(yàn)其Na2SeO3濃度15 mg/L。從9組試驗(yàn)中同樣可以看出，Na2SeO3濃度為5 mg/L時(shí)，其試驗(yàn)組粗多糖的羥自由基清除率明顯高于其他組，高濃度的Na2SeO3對(duì)粗多糖的抗氧化活性起到了抑制作用，該結(jié)果同DPPH清除率和超氧自由基清除率趨勢(shì)相同。綜合9組試驗(yàn)其菌絲體粗多糖對(duì)DPPH 清除率、超氧自由基清除率和羥自由基清除率結(jié)果可得出，Na2SeO3濃度對(duì)抗氧化活性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于不同的碳源和氮源對(duì)其的影響，第6組試驗(yàn)其抗氧化能力表現(xiàn)最好，該結(jié)果同菌絲體生物量、富硒率以及胞外酶活性結(jié)果相同。

圖7 不同組靈芝菌絲體粗多糖對(duì)羥自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of crude polysaccharides from different groups of G.oregonense mycelia to hydroxyl radicals

2.8 線性相關(guān)性分析

從表3中可以看出，生物量、硒含量、富硒率、粗多糖、胞外酶活性、以及抗氧化活性之間的相關(guān)性均為正向相關(guān)。其硒含量與生物量存在顯著相關(guān)性；富硒率與生物量和硒含量存在極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在0.8以上；粗多糖含量與生物量和硒含量以及富硒率存在極顯著相關(guān)性，同樣相關(guān)系數(shù)均在0.8以上；胞外酶POD和PPO與硒含量和富硒率存在極顯著相關(guān)性，相關(guān)系均達(dá)到0.9以上，與粗多糖在存在顯著相關(guān)性，POD和PPO相互之間也存在極顯著相關(guān)性；菌絲粗多糖的抗氧化活性與硒含量、富硒率均存在顯著相關(guān)性，而與生物量的相關(guān)系數(shù)較低，可見(jiàn)，硒含量和富硒率越高其粗多糖的抗氧化活性就高，而菌絲生物量多其抗氧化活性則不一定高。

表3 靈芝菌絲胞外酶活性、抗氧化活性與菌絲生長(zhǎng)之間的線性相關(guān)分析

注：**P<0.01;*P<0.05。

3 討論

3.1 富硒靈芝發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)分析

適合靈芝菌絲體生長(zhǎng)的碳源有葡萄糖、乳糖、馬鈴薯、淀粉等，適合的氮源有硫酸銨、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉、麩皮、酵母粉等，富硒源有活化硒礦、亞硒酸鈉等。對(duì)于富硒靈芝發(fā)酵條件篩選，前人做了大量的研究，集中于發(fā)酵過(guò)程中不同培養(yǎng)條件如溫度、pH等和培養(yǎng)基中不同的氮源、碳源以及外源硒等對(duì)菌絲體生物量和多糖產(chǎn)量的影響。Guo等[7]對(duì)富硒靈芝的碳源、氮源和亞硒酸鈉濃度做了篩選，結(jié)果表明以4%葡萄糖和20%馬鈴薯為碳源，以1%蛋白胨為氮源，濃度為0.01%的亞硒酸鈉為最優(yōu)條件；Chen[18]通過(guò)響應(yīng)面分析得出靈芝深層培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.13%、麩皮汁3.96%，菌絲體中總硒含量在150 μg/g以上，富硒率最高達(dá)到55%。Chen[19]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定兩種菌種液態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為酒糟80 g/L、麩皮7.5 g/L、豆粕粉10 g/L、葡萄糖5 g/L，該條件下紅芝菌生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)勢(shì)較好；Xu等[20]以靈芝胞內(nèi)多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化了發(fā)酵碳源、氮源，結(jié)果表明添加20%馬鈴薯、3.3%葡萄糖、3%麥麩、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4，其胞內(nèi)多糖的得率最高。本文在富硒靈芝發(fā)酵條件篩選中，優(yōu)選的碳源為20%的馬鈴薯，氮源為2%的麩皮，該研究結(jié)果與前人研究結(jié)果較相似，靈芝對(duì)碳源的利用較為廣泛，不僅能利用單糖、雙糖，而且也能利用多糖，葡萄糖是靈芝生長(zhǎng)較好的碳源，氮源以谷類有機(jī)氮源為主。

在富硒靈芝發(fā)酵培養(yǎng)的最適亞硒酸鈉濃度研究上，本文研究富硒發(fā)酵最適添加Na2SeO3為5 mg/L，這與較多研究者不同，例如Dou[21]和Yang[22]研究認(rèn)為添加1 000 μg/g的亞硒酸鈉靈芝菌絲體富硒率最高；Wang[23]研究認(rèn)為添加20 mg/L Na2SeO3，其富硒胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)到2.84 g/L，生物量為32.26 g/L。研究者得出最適靈芝菌絲生長(zhǎng)的不同亞硒酸鈉濃度，可能是由于所使用的靈芝菌種以及菌種活性的不同所導(dǎo)致的，另外本研究在Na2SeO3的無(wú)菌處理上采用的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，而其他研究者采用的是高壓滅菌，這也有可能導(dǎo)致研究得出不同的結(jié)論。這些研究結(jié)果雖然顯示的最適亞硒酸鈉濃度不同，但都表明在適宜的亞硒酸鈉濃度范圍內(nèi)，低濃度亞硒酸鈉可促進(jìn)靈芝菌絲體的生長(zhǎng)，而隨著硒濃度的升高，則會(huì)抑制靈芝菌絲體的生長(zhǎng)，硒是細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶等氧化酶活性中心的組成成分，可能正是由于低濃度亞硒酸鈉激活了菌絲體細(xì)胞的輔酶而促進(jìn)菌絲體的發(fā)育，高濃度的亞硒酸鈉則抑制了菌絲體細(xì)胞內(nèi)部分酶的活性[24,25]。

3.2 富硒靈芝發(fā)酵液胞外酶活性分析

靈芝屬于木腐性真菌，在菌絲生長(zhǎng)階段和子實(shí)體發(fā)育階段，其所需的營(yíng)養(yǎng)全部由菌絲從外界吸收獲得，而菌絲分解到體外的胞外酶對(duì)靈芝吸收營(yíng)養(yǎng)起著至關(guān)重要的作用。靈芝可以向培養(yǎng)基中分泌多種胞外酶，這些胞外酶把營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)，從而易被菌絲吸收利用。不同的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)靈芝菌絲分泌不同的胞外酶，其胞外酶活性的大小也不相同。He[26]研究了Na2SeO3對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)及菌絲生長(zhǎng)期間胞外酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的Na2SeO3能促進(jìn)靈芝菌絲生長(zhǎng)和胞外酶活性，高濃度的Na2SeO3可抑制菌絲生長(zhǎng)和胞外酶活性；Chen[27]研究發(fā)現(xiàn)在靈芝發(fā)酵過(guò)程中胞外酶活力具有較強(qiáng)的階段性，酶活性顯著升高后到平緩到逐漸下降，這些研究與本文的研究結(jié)果類似，本研究中發(fā)現(xiàn)胞外酶活性在添加濃度為5 mg/L的Na2SeO3時(shí)活性最高，當(dāng)Na2SeO3濃度提高到10和15 mg/L時(shí)，其活性則明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)胞外酶活性在從第3天到第9天時(shí)逐漸升高，之后則逐漸降低。

3.3 富硒靈芝菌絲粗多糖抗氧化活性分析

靈芝能夠從培養(yǎng)基質(zhì)中吸收20%～30%的無(wú)機(jī)硒，并將其中的絕大部分轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，而且，約有40%的有機(jī)硒存在于蛋白質(zhì)中，硒元素可以顯著地提高富硒靈芝中蛋白質(zhì)組分和硒多糖的抗氧化活性[28]。Du[29]發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體蛋白提取物清除自由基的能力較強(qiáng)，且清除能力與硒含量趨勢(shì)相同，Zhou[30]通過(guò)富硒靈芝比較體外靈芝硒多糖和普通多糖對(duì)自由基的清除率和還原力，發(fā)現(xiàn)靈芝硒多糖對(duì)自由基的清除率和還原能力明顯優(yōu)于普通的靈芝多糖，本研究結(jié)果同樣顯示靈芝菌絲粗多糖具有較好的抗氧化活性，且隨著Na2SeO3濃度的提高其粗多糖的抗氧化活性逐漸降低。有研究表明硒能提高谷胱甘肽過(guò)氧化酶的活性，具有加速分解或去除過(guò)氧化脂質(zhì)作用，保護(hù)細(xì)胞免遭過(guò)氧化作用的損傷，硒與多糖結(jié)合后可提高靈芝多糖清除自由基的能力。另有研究表明發(fā)酵液中適宜的硒濃度促進(jìn)了菌絲體的生長(zhǎng)，無(wú)機(jī)硒進(jìn)入菌絲后，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，一方面可促進(jìn)氨基酸和蛋白質(zhì)的合成，促使氨基酸結(jié)合更多的硒[31]，另一方面硒可取代靈芝多糖中甲氧基上的甲基，并以硒氧雙鍵的方式結(jié)合，增強(qiáng)了靈芝多糖的活性[32]。然而對(duì)于硒多糖的具體作用機(jī)理以及無(wú)機(jī)硒結(jié)合多糖的途徑方式還有待進(jìn)一步研究和探討。

4 結(jié)論