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    虎眼萬年青總皂苷誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

    2020-03-17 09:57:36汲晨鋒曲中原李文蘭
    關(guān)鍵詞:膜電位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)批號(hào)

    鄒 翔,周 林,張 月,宮 甜,汲晨鋒,曲中原,劉 學(xué),李文蘭

    哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心,哈爾濱 150076

    虎眼萬年青為百合科多年生草本植物虎眼萬年青(OrnithogalumcaudatumAit.)的干燥全草,又名海蔥,原產(chǎn)于非洲南部,上世紀(jì)八十年代經(jīng)朝鮮傳入我國,目前在我國各地均有廣泛栽培[1,2]。早在公元前1500年的埃及《埃伯氏古醫(yī)典》就對(duì)其應(yīng)用有記載。在我國民間多用于清熱解毒、消堅(jiān)散結(jié),治療癌癥、膽囊炎等疾病并取得了良好的療效[3]。現(xiàn)代化學(xué)與藥理學(xué)研究表明,皂苷類成分是虎眼萬年青抗腫瘤作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[4],并證明其對(duì)乳腺癌、肝癌、白血病等都具有顯著的抑制作用[5],但其具體的分子作用機(jī)制尚未完全闡明。本論文以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為對(duì)象,探討虎眼萬年青總皂苷(OCA-TS)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,并在此基礎(chǔ)上探討其誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為其藥用開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與儀器

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    OCA-TS由實(shí)驗(yàn)室自制(采用乙醇提取,正丁醇萃取后AB8大孔樹脂純化,30%~70%的乙醇洗脫部位。以薯蕷皂苷為對(duì)照品,采用香草醛-高氯酸顯色,紫外可見分光光度法測(cè)定純度為55%)。注射用羥基喜樹堿(HCPT,黃石飛云制藥有限公司,批號(hào):20130601),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào):20140507),RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司,批號(hào):20140713),胰蛋白酶(Sigma公司,批號(hào):20140918),AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天公司,批號(hào):20140921),F(xiàn)luo-3/AM(Molecular probe公司,批號(hào):20140309),MTT(批號(hào):20140108)、二甲基亞砜(DMSO,批號(hào):20140226)和羅丹明123(Sigma公司,批號(hào):20140912),小鼠抗人Cyt-C抗體和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20140817,20140911),多聚甲醛(博士德生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20130912),TritonX-100(上海華舜生物工程有限公司,批號(hào):20140606),BSA(美國BioVision公司,批號(hào):20130604)。其他試劑均為分析純。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株(哈爾濱商業(yè)大學(xué)抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心提供)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司),CO-150 CO2培養(yǎng)箱(美國NBS公司),CKX 41倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司),CX21光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司),Mode l680酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司),JEM-1220透射電子顯微鏡(日本電子公司),BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司),Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司),Mini-PROTEIN 3 電泳系統(tǒng)(美國Bio-rad公司),GIS-2019型凝膠成像系統(tǒng)(Tannon公司),TCS-SP2激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

    細(xì)胞生長至90%融合時(shí)吸去原培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞2次,加1 mL胰酶(0.25%)后,在倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)一半的細(xì)胞呈現(xiàn)圓粒狀時(shí),棄胰酶,加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液后將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁吹下,并混合均勻,按1∶4至l∶6的比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶后,加適量含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

    2.2 MTT法檢測(cè)OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

    將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞消化后,以4×104個(gè)/mL接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后,每孔加入OCA-TS溶液,使其終濃度為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL,陰性對(duì)照組加等體積的RMPI1640培養(yǎng)液,陽性對(duì)照組加入HCPT,終濃度為5 μg/mL。每組設(shè)6個(gè)平行孔。將96孔板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,而后棄上清液,并于每孔加入100 μL MTT溶液(0.5 μg/mL),于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2~4 h,棄上清液,每孔加入150 μL的DMSO,用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長490 nm處檢測(cè)吸光度(OD值),并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

    細(xì)胞抑制率=(空白組平均OD值-給藥組

    平均OD值)/空白組平均OD值×100%

    2.3 透射電鏡觀察OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

    將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL),并按每孔1 mL將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后加入OCA-TS,使其終濃度分別為25、50、100 μg/mL,陽性對(duì)照組HCPT的終濃度為5 μg/mL,陰性對(duì)照組加等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液,每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,立即用預(yù)冷的2%戊二醛固定24 h以上,切片,制成樣品,隨后進(jìn)行機(jī)器操作打開軟件并檢查電鏡狀態(tài),裝液氮隨后裝載樣品與插入樣品桿,加燈絲電流,完成以上準(zhǔn)備即可開始操作,透射電鏡下觀察并攝影,結(jié)束操作后取出樣品桿,卸載樣品。

    2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、Cyt-C蛋白的表達(dá)

    將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(同“2.3”項(xiàng)下方法),藥物作用48 h后,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次后,加入磷脂酰絲氨酸蛋白抗體(AnnexinⅤ-FITC)及碘化丙啶(PI)(50 μg/mL)染液,于室溫避光染色后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,F(xiàn)L1通道檢測(cè)FITC陽性,F(xiàn)L2檢測(cè)PI陽性。FITC 激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm;PI 激發(fā)波長為535 nm,發(fā)射波長為615 nm,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    羅丹明123是一種線粒體跨膜電位的指示劑,正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),熒光強(qiáng)度減弱或消失,而在線粒體膜完整性被破壞時(shí),羅丹明123重新釋放出線粒體 ,發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(同“2.3”項(xiàng)下方法),藥物作用48 h后,收集細(xì)胞,加入羅丹明123(Rhodamine123)染料,使其終濃度為10 μg/mL,避光孵育,離心棄染料,PBS洗2次,加PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Rh123的激發(fā)波長為507 nm,最大發(fā)射波長為529 nm,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(同“2.3”項(xiàng)下方法),藥物作用48 h后,收集細(xì)胞,加入4 g/L多聚甲醛2 mL固定40 min,PBS洗2次,0.1%TritonX-100 2 mL打孔15 min,離心去TritonX-100,PBS洗2次,1%BSA 2 mL封閉1 h,離心棄去封閉液,加鼠抗人Cyt-C抗體,37 ℃孵育1 h,加PBS洗1次,加FITC標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L)抗體,室溫避光孵育30 min,棄上清,重懸細(xì)胞,過濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)[6],F(xiàn)ITC激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。

    2.5 酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase-8、Caspase-3和Caspase-12的活性

    不同濃度OCA-TS作用48 h后(同“2.3”項(xiàng)下方法),收集細(xì)胞,取2×106個(gè)細(xì)胞加入裂解液,重懸沉淀,冰浴裂解,離心,將上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。遵循活性檢測(cè)試劑盒說明書操作,建立硝基苯胺(pNA)標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí),按要求對(duì)不同樣品加入相應(yīng)試劑和樣品,37 ℃孵育至肉眼可見顏色變化即可測(cè)定,如果變化不明顯可適當(dāng)延長至24 h,采用酶標(biāo)儀測(cè)定A405。由于Caspase可催化底物(AC-DEVD-pNA)產(chǎn)生黃色的游離硝基苯胺,通過分光光度比色法測(cè)定pNA在400~410 nm處吸光值,從而間接獲的Caspase的活性,進(jìn)一步計(jì)算Caspase-8和Caspase-3的活性。Caspase-12按說明書要求操作后,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)光波長488 nm,發(fā)射波長為530 nm。

    2.6 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

    不同濃度OCA-TS作用48 h后(同“2.3”項(xiàng)下方法),收集細(xì)胞,PBS重懸細(xì)胞,離心棄上清,加入4 μg/mL的Fluo-3/AM 200 μL,37℃避光孵育1 h,PBS洗2次,而后加400 μL PBS輕輕重懸細(xì)胞,過濾后用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)。

    2.7 Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中Fas、FasL和FADD蛋白的表達(dá)

    不同濃度OCA-TS作用24 h后(同“2.3”項(xiàng)下方法),PBS洗2次,加50 μL含PMSF裂解液裂解后,于4 ℃下12 000 rpm離心10 min,取離心后的上清,采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到NC膜上。將膜與β-actin、Fas、FasL和FADD等I抗(1∶200稀釋)置4 ℃冰箱中孵育過夜。而后用TBST緩沖液充分洗膜3次,每次振搖10 min。隨后采用相應(yīng)II抗(1∶500稀釋)室溫孵育2 h,AP-NBT/BICP顯色法顯色后,采用Tannon凝膠成像系統(tǒng)拍照,并進(jìn)行量化分析。

    2.8 數(shù)據(jù)處理

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。OCA-TS作用于MCF-7細(xì)胞72 h后,隨著OCA-TS濃度的增加,對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高,且呈一定的劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算,IC50為(93.17±0.02)μg/mL。

    圖1 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 The anti-proliferative effect of OCA-TS on the MCF-7 cells

    3.2 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。陰性對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞表面的微絨毛突起明顯。經(jīng)50 μg/mL的OCA-TS作用MCF-7細(xì)胞48 h后,可見細(xì)胞表面的微絨毛減少、染色質(zhì)固縮、有凋亡小體形成。HCPT作用MCF-7細(xì)胞48 h后,亦可見細(xì)胞表面的微絨毛消失,出現(xiàn)凋亡小體等凋亡特征。

    圖2 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(1000×)Fig.2 Effect of OCA-TS on the morphological appearance of MCF-7 cells (1000×)注:(a)MCF-7細(xì)胞空白對(duì)照組;(b)50 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞48 h;(c)50 μg/mL HCPT處理MCF-7細(xì)胞48 h。Note:(a) Control;(b) MCF-7 cells were treated with 50 μg/mL OCA-TS for 48 h;(c) MCF-7 cells were treated with 5 μg/mL HCPT for 48 h.

    3.3 OCA-TS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的凋亡率、線粒體膜電位、Cyt-C蛋白的表達(dá)

    凋亡率測(cè)定結(jié)果如圖3所示。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上下左象限顯示陰性對(duì)照的正常細(xì)胞(FITC-/PI-),下右象限為早期凋亡細(xì)胞(FITC+/PI-),上右象限是晚期凋亡及壞死細(xì)胞(FITC+/PI+),上左象限為破碎及損傷細(xì)胞。研究結(jié)果表明,25、50、100 μg/mL濃度的OCA-TS作用MCF-7細(xì)胞48 h后,凋亡早期和凋亡晚期細(xì)胞比率均呈上升趨勢(shì),具有一定的劑量依賴性。OCA-TS各組細(xì)胞的總凋亡率(早期及晚期凋亡細(xì)胞合計(jì))分別為(15.96±1.69)%、(20.64±1.78)%和(30.6±1.05)%,與陰性對(duì)照組(5.74±0.47)%比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    圖3 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡率Fig.3 Effect of OCA-TS on the apoptotic rates of MCF-7 cells 3注:(a)MCF-7細(xì)胞空白對(duì)照組;(b)5 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(c)50 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(d)100 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(e)5 μg/mL HCPT處理MCF-7細(xì)胞。Note:(a) Control;(b) 5 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(c) 50 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(d) 100 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(e) 5 μg/mL HCPT treated MCF-7 cell.

    線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。研究結(jié)果表明,25、50、100 μg/mL濃度的OCA-TS作用MCF-7細(xì)胞48 h后,線粒體膜電位分別為(69.77±0.36)%、(63.20±0.75)%和(68.13±0.25)%,與陰性對(duì)照組(68.40±0.17)%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCPT組細(xì)胞線粒體膜電位為(27.63±1.95)%,顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.01)。

    表1 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

    注:與空白對(duì)照組比較,**P< 0.01,下同。

    Note:Compared with control,**P< 0.01,the same below.

    圖4 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of OCA-TS on mitochondrial transmebrane potential of MCF-7 cells注:(a)MCF-7細(xì)胞空白對(duì)照組;(b)5 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(c)50 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(d)100 μg/mL OCA-TS處理MCF-7細(xì)胞;(e)5 μg/mL HCPT處理MCF-7細(xì)胞。Note:(a) Control;(b) 5 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(c) 50 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(d) 100 μg/mL OCA-TS treated MCF-7 cell;(e) 5 μg/mL HCPT treated MCF-7 cell.

    表2 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位、Cyt-C的影響

    OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞Cyt-C表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。不同濃度的OCA-TS 作用MCF-7細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)Cyt-C表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3.4 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12活性的影響

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。不同濃度的OCA-TS作用于MCF-7細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-8的活性均顯著升高,且呈一定的劑量依賴性;而OCA-TS各給藥組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12的熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05),陽性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的Caspase-12的熒光強(qiáng)度顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。

    表3 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12活性的影響

    3.5 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞Ca2+濃度的影響

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。研究結(jié)果表明,不同濃度的OCA-TS作用MCF-7細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與陰性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表4 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

    3.6 OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞Fas、FasL和FADD蛋白表達(dá)的影響

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5,圖6所示,不同濃度的OCA-TS作用于MCF-7細(xì)胞48 h后,MCF-7細(xì)胞內(nèi)Fas、FasL和FADD蛋白表達(dá)均顯著增加,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    4 討論與結(jié)論

    乳腺癌是全世界女性中最為常見的惡性腫瘤,高居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位,且發(fā)病率呈逐年升高的態(tài)勢(shì)[7-10]。乳腺癌的主要治療手段有手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌與中藥治療[11]。但目前尚無有效的治療藥物,發(fā)現(xiàn)高效低毒的治療藥物仍然是攻克乳腺癌的主要途徑之一。從天然藥物中發(fā)現(xiàn)抗乳腺癌的活性物質(zhì)一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。眾多研究表明,虎眼萬年青具有明確的抗腫瘤作用,以虎眼萬年青為君藥的復(fù)方萬年青膠囊已成為用于抑制乳腺癌,肺癌等轉(zhuǎn)移的中成藥。研究發(fā)現(xiàn)皂苷類成分是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖抑制作用[5]。本課題組在前期研究了OCA-TS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)OCA-TS可降低HepG-2細(xì)胞線粒體膜電位,上調(diào)Cyt-C 蛋白的表達(dá)水平,升高Caspase-3的酶活性,從而通過啟動(dòng)線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2。而在研究OCA-TS抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)OCA-TS可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡,但并未通過線粒體途徑[12]。為此,進(jìn)行了OCA-TS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三條經(jīng)典途徑的探索,確定具體的靶點(diǎn)[13]。

    圖5 OCA-TS 對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞 Fas、FasL和FADD蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of OCA-TS on the expressions of Fas,FasL and FADD proteins in MCF-7 cells

    圖6 OCA-TS對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞Fas、FasL和FADD蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of OCA-TS on the expression of Fas,FasL and FADD proteins in MCF-7 cells注:與空白對(duì)照組比較,** P < 0.01。Note:Compared with control,** P < 0.01.

    線粒體途徑是細(xì)胞凋亡經(jīng)典途徑之一,也是很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要作用途徑和機(jī)制[14,15]。因此,本研究首先檢測(cè)了OCA-TS對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位和Cyt-C的表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明,不同濃度的OCA-TS作用MCF-7細(xì)胞48 h后,細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)Cyt-C表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比沒有顯著改變(P>0.05),而陽性對(duì)照組HCPT呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)[16],說明OCA-TS作用于細(xì)胞后,并沒有通過影響線粒體膜電位使線粒體孔道開放而導(dǎo)致線粒體內(nèi)Cyt-C向胞漿的釋放,提示OCA-TS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡作用并不是通過啟動(dòng)線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是細(xì)胞凋亡的又一條經(jīng)典途徑。鈣離子失衡等多種因素均可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),造成大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應(yīng)[17]。一旦這種應(yīng)激程度過大,時(shí)間過長,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)得不到恢復(fù),就會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的凋亡信號(hào),促使細(xì)胞凋亡。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與Ca2+穩(wěn)態(tài)密切相關(guān),破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)和UPR反應(yīng),導(dǎo)致大量Ca2+釋放,進(jìn)而激活Caspase-12,觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[18]。本論文進(jìn)一步研究了OCA-TS對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和Caspase-12的活性的影響,結(jié)果表明OCA-TS作用細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和Caspase-12的活性沒有顯著升高,而陽性對(duì)照組HCPT呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)[19],提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑不是OCA-TS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的途徑和機(jī)制。

    死亡受體途徑是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的外源途徑,其中Fas/FasL系統(tǒng)在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起著重要的信號(hào)傳遞作用[20,21]。本論文進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),OCA-TS可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Fas、FasL和FADD蛋白的表達(dá),增加Caspase-3和Caspase-8的酶活性,陽性對(duì)照組HCPT也具有顯著性差異(P<0.01)[22]。說明OCA-TS可能是通過上調(diào)Fas和FasL的表達(dá),促進(jìn)Fas與三聚體的FasL相結(jié)合,F(xiàn)as通過胞內(nèi)段的DD 募集胞質(zhì)中的FADD,F(xiàn)ADD進(jìn)一步將Caspase-8募集到Fas區(qū)域,從而形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體。Caspase-8 酶原自我剪切活化成活性Caspase-8,活化的Caspase-8進(jìn)一步激活下游的Caspase-3,最終誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    綜上,OCA-TS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡作用可能是以Fas、FasL和FADD蛋白為靶點(diǎn),啟動(dòng)死亡受體途徑而不是通過線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑實(shí)現(xiàn)的。

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