漢江流域上游城鎮(zhèn)污水CAST處理工藝微生物群落結(jié)構(gòu)分析

蒙小俊，龔曉松，王秋利

（安康學院 旅游與資源環(huán)境學院，陜西 安康 725000）

發(fā)源于陜南秦巴山地的漢江流域是丹江口水庫的主要水源地，生態(tài)承載力處于弱可承載狀態(tài)，支流污染嚴重、生態(tài)環(huán)境質(zhì)量差、潛在威脅多，保護水源地生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，確保南水北調(diào)中線工程水質(zhì)安全、促進區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展、實現(xiàn)人與自然和諧共處一直是相關(guān)管理部門和學術(shù)界關(guān)心的熱點問題[1-2]。城鎮(zhèn)污水排放是漢江流域上游面臨的主要環(huán)境問題之一，污水處理廠能夠凈化水質(zhì)，改善環(huán)境，已成為漢江流域生態(tài)環(huán)境保護所必備的設(shè)施。漢江上游城鎮(zhèn)污水處理廠主要采用CAST、氧化溝、A2/O和BIOLAK工藝，占比分別為46%，29%，21%和4%。CAST工藝具有投資及運行費用低、運行簡單靈活及其選擇器能防止污泥膨脹等優(yōu)點[3]，可實現(xiàn)好氧、缺氧及厭氧狀態(tài)交替的環(huán)境，為同步脫氮除磷提供了有利條件，特別適合陜南多山少地地區(qū)的污水處理。

國內(nèi)外科研工作者對CAST工藝做了大量的相關(guān)研究[3-7]，但對工藝中起重要作用的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能鮮見分析。生物處理過程污泥相由復雜的微生物群落組成，以細菌為主的群落結(jié)構(gòu)在廢水處理過程中起至關(guān)重要的作用，生物群落決定廢水的處理效率，廢水處理系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性主要依靠優(yōu)勢微生物的活性和多樣化的群落結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系[8-10]。地球上存在106～108種微生物，而且其中絕大多數(shù)無法通過常規(guī)方法獲得純培養(yǎng)[11]。隨著生物新技術(shù)的發(fā)展，城鎮(zhèn)污水處理中的種群結(jié)構(gòu)受到廣泛關(guān)注。研究表明，城市生活污水中細菌種類比高氨氮廢水更豐富，優(yōu)勢菌群屬于Proteobacteria和Bacteroidete，而高氨氮廢水系統(tǒng)中AOB與NOB的數(shù)量都多于城市生活污水系統(tǒng)[12]；污水處理廠進水中AOB優(yōu)勢菌為Nitrosomonas，NOB的優(yōu)勢菌為Nitrospira，次優(yōu)勢菌為Nitrobacter，且與Nitrococcus、Nitrospina 并存[13]；Nitrosomonas、Nitrospira和Thauera菌是城鎮(zhèn)污水處理中檢測到的典型的AOB、NOB和反硝化菌，分別占5.82%、2.26%和4.30%[14]95；BIOLAK活性污泥中，參與氮、芳香化合物和磷代謝的功能基因比例分別為2.50%、2.28%和1.56%，氮代謝過程中，反硝化相關(guān)基因所占比重最高，達到80.81%，其次是氨化（12.78%）、硝化（4.38%） 和固氮（2.04%）[15]。盡管在城鎮(zhèn)污水處理中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能研究上取得了一定成果，但不同處理工藝和水質(zhì)嚴重影響微生物群落結(jié)構(gòu)，而漢江流域上游CAST處理工藝群落結(jié)構(gòu)和功能鮮見報道。由此對CAST工藝微生物進行分子生態(tài)學研究，有助于探討廢水處理工藝動態(tài)監(jiān)控和優(yōu)化控制，保證水源涵養(yǎng)地的水質(zhì)安全，保障南水北調(diào)中線工程供水的安全運行。本研究對采自漢江流域上游安康市某城鎮(zhèn)污水廠CAST處理工藝的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能進行分析，以期為廢水處理工藝的穩(wěn)定運行和優(yōu)化控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）、Qubit3.0 DNA檢測試劑盒 （Life）、2×Taq Master Mix（Vazyme）、MagicPure Size Selection DNA Beads（Transgen）。

1.2 實驗主要儀器

臺式離心機（Thermo Fishe）r、電泳槽（北京市六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP）、Qubit3.0熒光計（Invitrogen）、PCR儀（BIO-RAD）。

1.3 采樣

污泥采自漢江流域上游安康市某城鎮(zhèn)污水處理廠（樣品采集3個平行樣），該污水處理廠采用CAST工藝，工況依次為進水、曝氣、沉降、潷水，每個工況運行1.5h，每個周期運行6h。主要水質(zhì)指標見表1。

表1 污水處理廠生化單元主要水質(zhì)指標 （mg/L）

1.4 DNA提取、PCR和16S r DNA測序

DNA提取按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒說明進行。瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量（3個樣品DNA提取后等比例混合后作為后續(xù)的測試樣）。PCR擴增引物：341FCCTACGGGNGGCWGCAG和805RGACTACHVGGGTATCTAATCC，擴增區(qū)域為V3-V4。反應條件：94℃3min，94℃ 30s，45℃ 20s，65℃ 30s，5cycles；94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，20cycles；72℃ 5min，10℃。反應體系：2×Taq master Mix 15μL，Bar-PCR primer F（10μM） 1μL，Primer R（10μM） 1μL，Genomic DNA 10-20 ng，ddH2O 補至 30μL。PCR按上述條件和體系結(jié)束后進行第二輪擴增。第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR反應條件：95℃ 3min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，5cycles；72℃ 5min，10℃。PCR 反應體系：2×Taq master Mix 15μL，Primer F （10μM） 1μL，PrimerR（10μM） 1μ L，PCR產(chǎn)物（第一輪） 20ng，ddH2O補至30 μL。PCR結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，純化后進行高通量測序。

1.5 多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

原始序列數(shù)據(jù)預處理后利用Prinseq軟件進行質(zhì)控，采用Usearch軟件在97%的相似水平下進行生物信息統(tǒng)計分析，物種分類采用RDP classifier軟件進行。根據(jù)物種豐度情況，使用軟件Mothur中的summary.single命令，計算菌群Chao、ACE、Shannon、Simpson多樣性指數(shù)。通過在線平臺進行LEf Se分析，并使用PICRUSt軟件，利用直系同源蛋白（COG） 和京都基因百科全書（KEGG） 基因數(shù)據(jù)庫進行比對（BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值為10-5），根據(jù)比對結(jié)果使用KOBA2.0進行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 污泥菌群多樣性和組成

經(jīng)測序，污泥樣品獲得44896條有效測序條帶，OUT、Chao、 ACE和 Shannon指數(shù)分別為4031、15926.67、27300.6和5.83，覆蓋率為94%。為了解微生物群落結(jié)構(gòu)組成和豐度，分別從微生物門（phylum） 水平（見下頁圖1） 和屬（genus）水平（見下頁表2） 進行分類。如圖1所示，微生物優(yōu)勢門是Proteobacteria，豐度為40.31%；其次為Bacteroidetes、Chloroflexi、Planctomycetes、Candid-atus Saccharibacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia、Acidobacteria、Firmicutes和 Nitrospirae，豐度分別為16.85%、13.97%、6.21%、4.59%、3.83%、3.81%、2.4%、1.47%和0.64%；未分類和其他分別占4.48%和1.45%。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，Proteobacteria是污泥中微生物門水平上的主導門類[14,16]。

圖1 微生物群落結(jié)構(gòu)門水平上的分類

微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成和豐度（豐度大于0.5%）如表2所示，優(yōu)勢屬為Saccharibacteria、Zoogloea和 Gemmobacter，豐度分別為4.59%、3.94%和 3.5%，其次為 Ilumatobacter、Limnohabitans、Kofleria、Aridibacter、Rubinisphaera、 Phaeodactylibacter、Acidovorax、Ferruginibacter、Terrimonas、Flavobacterium、Dokdonella、Thermomonas、Methylotenera 、 Arcobacter、Acinetobacter、 Haliscomenobacter、 Nitrospira、Gimesia、Thauera、 Runella、Azospira和Dechloromonas，豐度分別為 1.8%、1.62%、1.52%、1.47%、1.27%、1.27%、1.25%、1.19%、1.13%、1.04%、0.93%、0.89%、0.78%、0.76%、0.73%、0.68%、0.63%、0.62%、0.56%、0.55%、0.54%和0.51%。Zoogloea是兼性好氧細菌，在許多污水處理廠活性污泥中都占優(yōu)勢地位，能降解有機物，可脫氮除磷[17]；Nitrospira是活性污泥中起硝化作用的主要菌屬[18]；活性污泥中與反硝化作用有關(guān)的主要菌屬包括：Azoarcus、Thauera、Comamonas、Rhodobacter、Rhodocyclus 和 Dechloromonas 等[19]，本研究中發(fā)現(xiàn)了Thauera、Comamonas和Dechloromonas菌，這些菌株可能參與反硝化作用；同時Dechloromonas具有除磷功能[20]。Terrimonas菌能發(fā)生好氧反硝化[21]，而反硝化菌Azospira屬聚磷菌的一種，可以進行污水除磷[22]，F(xiàn)lavobacterium菌被證明具有解磷作用，能將周圍環(huán)境中的有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷[14]97。以上數(shù)據(jù)表明CAST生物系統(tǒng)具有良好的脫氮除磷性能。

表2 微生物群落結(jié)構(gòu)屬水平上的分類

2.2 活性污泥中的基因功能分析

活性污泥中的基因功能分析如表3所示，與碳水化合物的新陳代謝、氨基酸的新陳代謝、氮素代謝和甲烷代謝相關(guān)的基因豐度分別為3.15%、8.64%、0.74%和1.04%。主要的碳水化合物正常的代謝途徑包括糖酵解、三羧酸循環(huán)和碳水化合物的運輸，這是典型高效的活性污泥中微生物能量產(chǎn)生和生物合成的過程[14]99，糖酵解和三羧酸循環(huán)的基因豐度分別為1.04%和0.85%。COG注釋分析表明CAST工藝污泥中與微生物新陳代謝相關(guān)的基因占36.11%，其中氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、碳水化合物的運輸和新陳代謝、無機物運輸和新陳代謝分別占7.54%、6.01%、5.50%和5.08%，這與表3的結(jié)果基本一致。細胞壁和細胞膜占6.73%，這對于生物膜形成有重要意義，微生物在形成和降解EPS時會比較活躍。

表3 活性污泥中的基因功能分析

續(xù)表

3 結(jié)論

（1）漢江流域上游城鎮(zhèn)污水CAST處理工藝微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)勢門為Proteobacteria，與脫氮除磷有關(guān)的菌屬有Zoogloea、Dechloromonas、Nitrospira、Terrimonas、Thauera和Azospira。

（2）參與碳水化合物新陳代謝、氨基酸新陳代謝和氮素代謝相關(guān)的基因豐度分別為3.15%、8.64%和0.74%；細胞壁和細胞膜占6.73%。