不同產(chǎn)地丫蕊花不同部位中3種皂苷成分含量測定及差異分析

陳帥 張美 袁崇均 羅森 王笳

中圖分類號R917;R284.1

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1001-0408（2020）03-0325-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.14

摘要 目的：建立測定丫蕊花中重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量的方法，比較不同產(chǎn)地丫蕊花不同部位中這3種皂苷成分的含量差異。方法：采用高效液相色譜法測定10個產(chǎn)地丫蕊花的全草部位和地下部位中重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，色譜柱為Kromasil C¹⁸，流動相為乙腈一水（梯度洗脫），流速為1.OmL/min，柱溫為35℃，檢測波長為203nm，進樣量為10μL。以3種皂苷成分的含量為指標(biāo)，對20批次丫蕊花進行聚類分析和偏最小二乘判別分析，對樣品進行聚類區(qū)分，并確定其主要差異性成分。結(jié)果：重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的檢測質(zhì)量線性范圍分別為0.051～2.04、O.OO7～0.28、0.168～6.72μg（r≥0.9995）;檢測限分別為1.92、1.75、1.87ng，定量限分別為6.40、5.87、6.23ng;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24h）的RSD均小于2% （n=6）;平均回收率分別為99.29%、101.38%、99.64%，RSD分別為1.17%、2.64%、0.75%（n=6）。20批次樣品的重樓皂苷Ⅱ含量為0.615～1.875mg/g，重樓皂苷Ⅵ含量為0～0.095mg/g，重樓皂苷Ⅶ含量為3.158～12.354mg/g。聚類分析結(jié)果顯示，20批次樣品被聚為兩類，批次S9～S12為一類，其余16批次樣品被聚為一類;偏最小二乘判別分析結(jié)果顯示，20批次樣品分為3個區(qū)，批次Sl、S2、S8、S14、S16、S20被分為I區(qū)，批次S9～S12被分為Ⅱ區(qū)，其余樣品被分為Ⅲ區(qū)。不同產(chǎn)地的丫蕊花存在品質(zhì)差異，且全草和地下部位中3種皂苷成分無差異性。權(quán)重排序結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅶ為丫蕊花藥材中主要差異性成分，其中彭州和大邑縣產(chǎn)丫蕊花藥材中重樓皂苷Ⅶ最高。結(jié)論：本方法簡單方便、靈敏度高，可用于丫蕊花中3種皂苷成分的含量測定。以彭州和大邑縣產(chǎn)丫蕊花活性成分含量較高、質(zhì)量較好。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;丫蕊花;重樓皂苷Ⅱ;重樓皂苷Ⅵ;重樓皂苷Ⅶ;聚類分析;偏最小二乘判別分析

丫蕊花（Ypsilandra thibetica Franch）為百合科丫蕊花屬植物，據(jù)《中華本草》記載，丫蕊花在民間以全草入藥，具有清熱、解毒、止血、活血、散結(jié)、利小便之功效，主治瘰疬、小便不利、水腫[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，丫蕊花主要成分為甾體皂苷，迄今為止，已報道的從丫蕊花中分離出的甾體皂苷類化合物有50余種，還分離出了黃酮類化合物和糖酯類化合物[4-6]，丫蕊花提取物具有與重樓提取物相似的藥理活性[7]。由于目前重樓的市場年消耗量遠(yuǎn)超出其年生長量，加之重樓資源再生周期長，為此有必要從其他植物資源中尋找重樓的替代品。基于此，本文參照2015年版《中國藥典》（一部）重樓的質(zhì)量控制方法[8]和文獻方法[9-12]，建立丫蕊花中重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量測定方法，并采用聚類分析和偏最小二乘判別（PLS-DA）分析10個產(chǎn)地丫蕊花全草部位和地下部位中上述3種皂苷成分含量的差異，為丫蕊花藥材的質(zhì)量控制提供參考，也為丫蕊花替代重樓奠定了基礎(chǔ)。

l 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agi-lent公司）;BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sarto-rius公司）;KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）;Integral 3型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

丫蕊花采摘于四川屏山、什邡、寶興、古藺、彭州、大邑、興文、瀘州、，壽、浦江等地，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院資源與種植研究所張美副研究員鑒定為百合科丫蕊花屬植物丫蕊花的全草或根莖，依次記為批次S1～S20;重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺篗UST-17021906，純度：>98%）、重樓皂苷Ⅵ對照品（批號：MUST-17052210，純度：>98%）、重樓皂苷Ⅶ對照品（批號：MUST-17052211，純度：>98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;乙腈為色譜純;乙醇、甲醇為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：KromasilC¹⁸（150mmx4.6mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（O→30min.30%A→60%A）;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;檢測波長：203nm;進樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液精密稱取重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ各對照品適量，分別置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制咸含重樓皂苷Ⅱ1.02mg/mL、重樓皂苷Ⅵ0.14mg/mL、重樓皂苷Ⅶ1.68mg/mL的對照品貯備液。分別精密量取重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌焚A備液1mL、重樓皂苷Ⅵ對照品貯備液1mL、重樓皂苷Ⅶ對照品貯備液2mL，置于同-10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含重樓皂苷Ⅱ0.102mg/mL、重樓皂苷Ⅵ0.014mg/mL、重樓皂苷Ⅶ0.336mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取丫蕊花粉末（過三號篩）約0.50g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量后，加熱回流30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量空白對照液（甲醇溶液）、混合對照品溶液和供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ與其他組分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5000，空白對照對其測定無干擾。高效液相色譜圖見圖1（空白對照溶液圖略）。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1、2、5、10、15、20μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸分析，結(jié)果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，以甲醇逐級稀釋，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3：1、10：1時，分別測得檢測限和定量限。結(jié)果，重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的檢測限分別為1.92、1.75、1.87ng，定量限分別為6.40、5.87、6.23ng。

2，6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10μL，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.52%、0.88%、0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，室溫下放置O、2、4、6、12、24h后，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.65%、0.97%、0.40%（n=6）.表明供試品溶液在室溫條件下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批丫蕊花粉末（批次：S5）6份，每份0.5g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。結(jié)果，重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的平均含量分別為0.782、0.095、7.265mg/g，RSD分別為1.06%、1.35%、0.64%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的、r蕊花粉末（批次：S5）6份，每份0.25g，精密稱定，分別精密加入重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品適量，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量并計算回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

分別取20批次的丫蕊花粉末各0.5g，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，代入回歸方程計算重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，平行測定2次，取均值，結(jié)果見表3。

2.11 聚類分析

聚類分析是一種根據(jù)樣品自身的屬性，用數(shù)學(xué)方法按照某種相似性或差異性指標(biāo)，定量地確定樣品之間的親疏關(guān)系，并按這種親疏關(guān)系程度對樣品進行聚類的探索性分析方法[13]。本研究以重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量作為指標(biāo)，采用SPSS 22.O軟件對20批次的丫蕊花樣品進行聚類分析，結(jié)果見圖2。

由圖2顯示，20批次的丫蕊花樣品一共聚為兩大類，其中批次S1～S8、S13～S20聚為第一大類，批次S9～S12聚為第二大類。隨著距離系數(shù)的減小，第一大類可繼續(xù)分為A、B兩類，第二大類繼續(xù)分為C、D兩類，四類區(qū)分明顯，直接顯示出不同產(chǎn)地的丫蕊花存在品質(zhì)差異。分析同一地區(qū)不同部位樣品的類別發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)丫蕊花的全草部位和地下部位未被明顯區(qū)分，表明全草部位和地下部位中3種皂苷成分未出現(xiàn)明顯差異。

2.12 PLS-DA

PLS-DA是一種可靠、穩(wěn)健的判別分析統(tǒng)計方法，適用于樣品質(zhì)量控制及類別預(yù)測，可顯示出樣本之間差異主要是由哪些變量引起的。為了更好地分析20批次丫蕊花之間重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量的差異，本研究選取該20批次樣品為觀察對象，記為Y變量，以3種皂苷成分含量記為X變量，采用SIMCA-P 11.5軟件進行PLS-DA。結(jié)果，監(jiān)督模型解釋率為0.786、模型預(yù)測率為0.705，兩者相近且大于0.5，證明模型穩(wěn)定、預(yù)測能力較好。20批次丫蕊花樣品被分成3區(qū)，批次Sl、S2、S8、S14、S16、S20被分為I區(qū)，批次S9～S12被分為Ⅱ區(qū)，其余樣品被分為Ⅲ區(qū)，3個區(qū)區(qū)分明顯，直觀顯示出樣品間的差異。分析同一地區(qū)丫蕊花全草部位和地下部位中3種皂苷成分含量，兩者未顯示出顯著性差異。以含量較高的重樓皂苷Ⅶ為主成分1、重樓皂苷Ⅱ為主成分2，以其投影的得分值t[l]、t[2]為坐標(biāo)生成PLS-DA得分圖。20批丫蕊花樣品的PLS-DA得分圖見圖3。

進一步分析重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的變量權(quán)重重要性排序值（VIP），篩選出影響樣品分區(qū)的主要差異性成分。結(jié)果，重樓皂苷Ⅶ色譜峰的VIP>重樓皂苷Ⅱ色譜峰的VIP>重樓皂苷Ⅵ色譜峰的VIP，其中重樓皂苷Ⅶ色譜峰的VIP>1，表明重樓皂苷Ⅶ為丫蕊花藥材的主要差異性成分。3種皂苷成分的VIP圖見圖4。

3 討論

3.1 提取方法的篩選

筆者前期對丫蕊花藥材的提取溶劑（甲醇、乙醇）、提取工藝（水浴回流、超聲）、提取時間（15、30、60min）等影響因素進行考察。結(jié)果，以乙醇回流超聲30min提取后，色譜峰數(shù)量及響應(yīng)值均不再增加，提示所測成分已基本提取完全，且該提取工藝簡單、耗時短、易操作、毒副作用小，故以此作為本研究丫蕊花藥材的提取方法。

3.2 不同產(chǎn)地丫蕊花不同部位的差異

本研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地丫蕊花的重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ成分含量存在差異，其中彭州（地下部位）的、r蕊花中重樓皂苷Ⅶ含量最高，達到12.36mg/g，屏山（地下部位）的丫蕊花中重樓皂苷Ⅱ含量最高，達到1.88mg/g，少數(shù)地區(qū)的丫蕊花藥材未檢出重樓皂苷Ⅵ。分析聚類分析和PLS-DA結(jié)果顯示，雖然二者的分區(qū)結(jié)果稍有區(qū)別，但均將樣品S9～S12聚為一類，原因可能是這4批次的丫蕊花中重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量均比較高，與其余批次丫蕊花樣品區(qū)分明顯，可間接說明彭州和大邑縣非常適合丫蕊花藥材的生長及栽培，且地下部位和全草部位中3種皂苷成分的含量差異不明顯;VIP結(jié)果提示重樓皂苷Ⅶ為丫蕊花藥材的主要差異性成分。

3.3 丫蕊花的市場價值

藥理研究表明，丫蕊花具有顯著的抗腫瘤作用，對皮膚癌、子宮癌、肝癌、肺癌、咽喉癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用[14-16];Xie BB等[16]研究發(fā)現(xiàn)丫蕊花中的2種螺甾皂苷對5種人腫瘤細(xì)胞株（K562、SPC-A-1、BGC-823、Eca-109、AGS）具有體外毒性，對多種植物病原真菌和動物致病性細(xì)菌具有抑制作用;LiuHY等[17]研究發(fā)現(xiàn)丫蕊花皂苷P對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和急性粒細(xì)胞門血病HL-60細(xì)胞具有抑制作用;陳昌祥等[18]還從丫蕊花中提取分離出一種高含量的止血活性成分Y-l，適用于出血性疾病，完成了婦科止血新藥“峨眉苷膠囊”及其原料藥“峨眉苷”的臨床前研究。由此表明，丫蕊花具有值得深入開發(fā)利用的市場價值。

此外，本研究考察了不同產(chǎn)地丫蕊花不同部位中重樓皂苷Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，結(jié)果顯示，多數(shù)產(chǎn)地的丫蕊花均能達到2015年版《中國藥典》（一部）對重樓中相關(guān)皂苷成分含量的規(guī)定（重樓皂苷I、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ總含量不得少于0.6%）[8]，為丫蕊花替代重樓奠定了基礎(chǔ)。

3.4 問題和不足

由于本研究為普查項目，目前的采收產(chǎn)地僅限于四川境內(nèi)，樣品數(shù)量代表性不夠充分，下一步研究將考察省外產(chǎn)地，豐富樣本數(shù)量，并對彭州和大邑縣的、r蕊花藥材進行深入調(diào)研，包括氣候、海拔、土壤等自然因素和人工培育技術(shù)，并利用化學(xué)方法分離、純化丫蕊花的專屬成分，以助于充分開發(fā)利用丫蕊花藥材資源。

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（收稿日期：2019-11-11修回日期：2019-12-15）

（編輯：鄒麗娟）