模擬葡萄汁/葡萄酒體系中白藜蘆醇穩(wěn)定性的研究

張樂宏，樸美子，單凌越，劉淑芬，李巖*

（青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島 266109）

白藜蘆醇（Resveratrol），又稱芪三酚，在植物中與糖形成糖苷，常以不變化的反式糖苷和自由態(tài)形式存在[1-2]。白藜蘆醇在紅葡萄酒中的含量一般為1 mg/L，而在白葡萄酒中的含量為0.1～0.2 mg/L[3-4]。陳夢微等[5]研究表明，不同葡萄品種和組織中白藜蘆醇含量存在差異，整體表現(xiàn)為果梗＞果皮＞種籽，果皮紫黑色品種＞紅色品種＞黃綠色品種。白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗病毒、抵抗自由基、保護心血管系統(tǒng)等作用[6-9]。

白藜蘆醇的穩(wěn)定性受多種理化因素的影響?？娢挠竦萚10]的研究表明，白藜蘆醇受溫度和紫外光的影響比較大，對室內(nèi)日光燈照射比較穩(wěn)定。朱屹東等[11]研究表明，較高的溫度、pH以及培養(yǎng)基中蛋白胨的存在，均會導致白藜蘆醇降解速率的加快；而在低溫、酸性及不含蛋白胨的條件下白藜蘆醇穩(wěn)定性較高。鄭湘娟等[12]研究表明，在pH為3、白藜蘆醇質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、提取溫度50 ℃條件下，既會提高白藜蘆醇的提取率，又能夠保持相對穩(wěn)定，各因素的影響大小順序為提取液pH＞提取溫度＞白藜蘆醇質(zhì)量濃度＞存放時間。王錕等[13]研究表明，低溫避光有利于白藜蘆醇的穩(wěn)定，高溫光照不利于白藜蘆醇的穩(wěn)定；在光與熱的作用下，白藜蘆醇溶液均不穩(wěn)定。

葡萄酒釀造條件涉及SO2、微量元素、CaCO3、皂土、明膠、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、活性炭、山梨酸鉀、抗壞血酸、橡木片等多種因素。SO2可抑制或推遲葡萄酒中各成分的氧化[14-15]；果膠酶可改善葡萄酒色澤與酒體質(zhì)量[16-18]；明膠能使酒體清澈，降低色度損失[19-20]；皂土可促進葡萄酒澄清、穩(wěn)定[21-22]；PVPP對酚類物質(zhì)具有較強的吸附能力；活性炭能夠吸附并除去部分物質(zhì)；山梨酸鉀和抗壞血酸可防止葡萄酒變質(zhì)；CaCO3可與酒中的酸類進行中和降酸；橡木片能賦予葡萄酒一定的香氣[23-24]。上述釀造條件的變化可能影響葡萄酒中白藜蘆醇的穩(wěn)定性。

鑒于葡萄酒成分的復雜性，本研究僅探討了典型的釀造條件（SO2、皂土、抗壞血酸等）對自由水、葡萄糖、酒精、白藜蘆醇、酒石酸構建的模擬葡萄汁和葡萄酒體系中白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響?；诰S持白藜蘆醇的穩(wěn)定性同時減少損失，本研究為改善葡萄酒釀造工藝、提高葡萄酒質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與來源

白藜蘆醇標準品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇：萊陽康德化工有限公司；酒石酸：河南云創(chuàng)化工有限公司；葡萄糖：蘇州全鼎化工科技有限公司；皂土（取5 g皂土于燒杯中，添加80 ℃熱水適量消融，然后定容至100 mL，在水浴鍋中80 ℃時活化5 h，自然冷卻，配制成50 g/L濃度的皂土溶液）：上海試四赫維化工有限公司；明膠（稱取0.5 g明膠放到燒杯中，添加一定量40 ℃溫水消融，再定容至100 mL，配置成5 g/L濃度的明膠溶液）：法國拉曼公司；PVPP：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；活性炭：鞏義市華康水處理材料有限公司；偏重亞硫酸鉀：鄭州志遠化工產(chǎn)品有限公司；山梨酸鉀：泉州眾鑫實業(yè)有限公司；抗壞血酸：安徽遠征生物工程有限公司；CaCO3：天津市燕東浩天礦產(chǎn)品有限公司；橡木片（天然）：北京君悅誠品科貿(mào)有限公司。

1.1.2 儀器

BP210S電子天平：珠恒電子有限公司；WH-5600紫外分光光度計：Varian公司；Allegra X-22R高速臺式離心機：美國Beckman Coulter有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬葡萄汁/葡萄酒體系的構建

本研究模擬葡萄酒釀造過程，參照任健[25]研究報道，構建兩種模擬體系（表1）：模擬葡萄汁體系和模擬葡萄酒體系（以真實葡萄酒為參考）。兩種模擬體系是基于酒精度和葡萄糖含量的差異而構建，不考慮兩種模擬體系中白藜蘆醇的實際含量及差異性，僅僅研究不同工藝條件對其白藜蘆醇的穩(wěn)定性的影響。

1.2.2 不同釀造條件對模擬葡萄汁/葡萄酒體系中白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響

（1）K2S2O5處理（模擬發(fā)酵前工藝）。準確移取配制好的模擬葡萄汁體系溶液5 mL于試管中，以20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L為濃度梯度添加K2S2O5（參照SO2添加量，以確定K2S2O5添加量對白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響），無添加組為對照，每個梯度設3組平行，然后置于35 ℃暗室中存放16 h，于306 nm下測其吸光值，白藜蘆醇的穩(wěn)定性以Abs樣品/Abs空白表示。

（2）降酸工藝及K2S2O5處理（后發(fā)酵工藝）。以0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L為濃度梯度添加CaCO3；以20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L為濃度梯度添加K2S2O5。將經(jīng)由以上所獲樣品置于暗室環(huán)境下保存16 h，分別研究二者對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響。

（3）穩(wěn)定工藝。以4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L為濃度梯度添加活性炭；以60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L為梯度添加明膠；以200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L為梯度添加PVPP；以300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L為濃度梯度添加皂土，于35 ℃暗室環(huán)境下保存16 h，分別研究4者對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響。

（4）裝瓶工藝。以40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L為梯度添加山梨酸鉀；以40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L為濃度梯度添加抗壞血酸，于35 ℃暗室環(huán)境下保存16 h，分別研究二者對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響。

（5）陳釀工藝。以1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L為梯度添加橡木片，于35 ℃暗室環(huán)境下保存16 h，研究其對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響。

1.2.3 不同釀造條件對模擬葡萄汁/葡萄酒中白藜蘆醇穩(wěn)定性的相關性分析

對上述不同釀造條件下葡萄汁/葡萄酒模擬體系中白藜蘆醇的穩(wěn)定性進行相關性分析。以橫坐標為釀造條件中因素的梯度變化，縱坐標為Abs樣品/Abs空白，其中，Abs樣品/Abs空白表示模擬葡萄汁/葡萄酒體系中白藜蘆醇的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 K2S2O5對白藜蘆醇的影響

本試驗中，1分子的K2S2O5可產(chǎn)生1分子的SO2。如圖1所示，添加不同濃度的K2S2O5后，與空白相比，模擬葡萄酒體系樣品吸光值在總體上有所減小，這表明白藜蘆醇含量在一定程度上減少，SO2對白藜蘆醇發(fā)生了反應。與20 mg/L的K2S2O5添加量相比，30 mg/L、40 mg/L的K2S2O5添加量對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量呈顯著下降趨勢；與30mg/L、40 mg/L的K2S2O5添加量相比，50 mg/L、60 mg/L的K2S2O5添加量對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量也呈顯著下降趨勢。這可能是由于SO2具有抗氧化作用，其能夠與白藜蘆醇結構中的雙鍵反應，破壞白藜蘆醇的正常結構導致測定吸光值下降。因此，白藜蘆醇含量隨SO2添加量的增加而顯著下降。

如圖1所示，隨K2S2O5添加量的增加，SO2濃度升高。與空白相比，模擬葡萄汁體系樣品吸光值差異不顯著。這表明，模擬葡萄汁體系中添加SO2與白藜蘆醇相互作用不明顯，白藜蘆醇含量不變化。這可能是由于模擬葡萄汁體系中含有葡萄糖（180 g/L），SO2能夠與糖相結合，生成不穩(wěn)定化合物，對白藜蘆醇起到一定的保護作用。由此可知，白藜蘆醇含量在模擬葡萄汁體系隨SO2添加量的增添而穩(wěn)定。

不同體系相比較，在模擬葡萄酒體系中SO2因氧化作用與白藜蘆醇結構中雙鍵反應，使之減少；模擬葡萄汁體系中，SO2因糖保護作用與白藜蘆醇不反應，保持穩(wěn)定狀態(tài)。兩種模擬狀態(tài)下，SO2有著不同的作用，進而對白藜蘆醇產(chǎn)生的影響也不同。

2.2 CaCO3對白藜蘆醇的影響

如圖2所示，CaCO3通常作為一種降酸劑應用于蘋果酸-乳酸發(fā)酵工藝中。隨CaCO3添加量的增加，與空白相比，樣品吸光值持續(xù)減小，存在顯著性。這表明，CaCO3或者酒石酸鈣（CaCO3與酒石酸反應生成物）對白藜蘆醇有吸附作用，進而使白藜蘆醇含量降低。因此，模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇的含量隨CaCO3添加量的增加而減少。

2.3 皂土對白藜蘆醇的影響

皂土是一種常見的下膠劑。如圖3所示，隨著皂土添加量的增加，與空白相比，樣品吸光值呈下降趨勢，且差異顯著。這表明，隨著皂土濃度的增大，其對白藜蘆醇的吸附作用得到增強，白藜蘆醇含量隨著皂土添加量的增加而減少。這可能是由于皂土經(jīng)過活化，其吸附作用得到提升，進而使白藜蘆醇含量減少?？傊?，白藜蘆醇含量隨皂土添加量的增加而減少。

2.4 明膠對白藜蘆醇的影響

如圖4所示，與空白相比，隨著明膠添加量的增加，樣品吸光值整體呈小幅下降趨勢。這表明，白藜蘆醇含量隨明膠添加量的增加而減少。這可能是由于明膠對白藜蘆醇的吸附作用微弱，樣品組之間試驗結果無顯著性差異。明膠能通過氫鍵或疏水基與葡萄酒中酚類化合物發(fā)生膠連進而生成聚合物，致使明膠蛋白變性，由原來的親水膠體轉(zhuǎn)變?yōu)樵魉z體，進而與酒體中存在的陽離子彼此吸引，發(fā)生凝聚，形成絮狀沉淀，從而澄清葡萄酒[26]。模擬體系中的白藜蘆醇作為多酚類物質(zhì)可與明膠蛋白發(fā)生聚合反應，形成絮狀沉淀，進而減少了白藜蘆醇的含量。由圖4可知，隨著明膠濃度的增加，樣品組吸光值變化輕微，可能是由于明膠與白藜蘆醇的聚合反應存在限值，與明膠含量的多少無關。由此，推測白藜蘆醇隨明膠添加量的增加而減少且趨于穩(wěn)定。

2.5 PVPP對白藜蘆醇的影響

PVPP是一種合成下膠劑，其下膠作用溫和，既不致使葡萄酒香氣喪失，亦可有目的地除去葡萄酒中的酚類物質(zhì)，在短期內(nèi)吸附微小殘留物，可與其他穩(wěn)定劑一起使用，以澄清葡萄酒。如圖5所示，隨PVPP添加量的增加，與空白相比，樣品吸光值整體呈下降趨勢，且200～400 mg/L范圍內(nèi)的PVPP添加量，樣品吸光值大致相平，不存在顯著性差異，而500 mg/L、600 mg/L樣品組與200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L樣品組吸光值存在顯著性差異。這可能是由于PVPP下膠后，隨著其濃度增大，吸附效果得到提升，與葡萄酒中易發(fā)生褐變及產(chǎn)生澀味的酚類物質(zhì)結合，短期內(nèi)有效除去細微殘渣，快速澄清溶液。模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇作為多酚類物質(zhì)，極易被PVPP吸附，白藜蘆醇含量下降增多。因此，整體而言，白藜蘆醇的含量隨PVPP添加量的添加而減少。

2.6 活性炭對白藜蘆醇的影響

如圖6所示，隨活性炭添加量的增加，與空白相比，樣品吸光值呈下降趨勢，且吸光值減小的幅度較大，且存在顯著性差異?；钚蕴康奶砑恿孔? g/L上升至16 g/L時，樣品吸光值逐漸減小，這是由于活性炭的吸附強度隨添加量的增加而增強。活性炭添加量為20 g/L時，該試驗組吸光值出現(xiàn)驟增趨勢，其原因可能是活性炭添加量過高，干擾了吸光值的測定。這表明，隨著活性炭添加量的增加，其對白藜蘆醇的吸附作用得到增強，白藜蘆醇含量大幅度減少。

由圖3～圖6可知，穩(wěn)定工藝中，皂土、明膠、PVPP、活性炭等4種澄清劑皆因自身的吸附能力而使模擬葡萄酒體系中的白藜蘆醇出現(xiàn)減少的現(xiàn)象，但在吸附能力與原理方面存在差異。

2.7 山梨酸鉀對白藜蘆醇的影響

如圖7所示，隨山梨酸鉀添加量的增加，與空白相比，樣品吸光值隨著山梨酸鉀添加量的增加而呈上升趨勢。由于山梨酸鉀與白藜蘆醇均存在共軛雙鍵結構，故在306 nm處山梨酸鉀與白藜蘆醇可能存在紫外吸收峰，這在一定程度上造成所測樣品吸光值大于原始值。

2.8 抗壞血酸對白藜蘆醇含量的影響

如圖8所示，隨抗壞血酸添加量的增加，與空白相比，吸光值連續(xù)減小，且存在顯著性差異。這表明，模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇的濃度呈下降趨勢，且存在顯著性差異。抗壞血酸具有很強的還原性，即抗氧化作用。在裝瓶前添加到葡萄酒中，可使酒中溶氧與其反應，減少溶氧量，防止破壞，與白藜蘆醇無反應。圖8中吸光值的下降可能是由于模擬葡萄酒體系中添加的是溶液，抗壞血酸溶液的添加對模擬葡萄酒體系起到稀釋作用而使白藜蘆醇濃度變小，吸光值呈現(xiàn)下降趨勢。

2.9 橡木片對白藜蘆醇的影響

如圖9所示，隨天然橡木片添加量的增加，與對照相比，1～2 g/L的橡木片添加量，樣品吸光值有所減小，3～5 g/L的吸光值要有所增加，1～2 g/L的橡木片添加量與3～5 g/L的橡木片添加量在對模擬葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響效果存在顯著性差異。由此，可推斷橡木片添加量為1～2 g/L時，其對白藜蘆醇含量無影響或有輕微的吸附作用。橡木片中存在的單寧等復雜的多酚類物質(zhì)，在葡萄酒陳釀進程中會浸漬到溶液中，使釀制的葡萄酒更符合人們的口味。模擬體系中的酒精成分會使添加的橡木片中成分浸出，橡木片浸出物如單寧、木質(zhì)素等在306 nm下存在著吸光值，對3～5 g/L來說，添加量越多，浸出物質(zhì)多，吸光值越大。

2.10 不同釀造條件與模擬葡萄汁/葡萄酒體系中白藜蘆醇穩(wěn)定性的相關性分析

圖10中，縱坐標數(shù)值＞1表示該釀造條件對葡萄汁/葡萄酒體系吸光值比空白組吸光值大，說明該釀造條件對白藜蘆醇的穩(wěn)定性影響不明確；縱坐標數(shù)值＜1表示該釀造條件對葡萄汁/葡萄酒體系吸光值比空白組吸光值小，說明在該釀造條件下白藜蘆醇的穩(wěn)定性降低或使其含量減少。由圖10可知，隨著不同釀造條件添加量的增加，不同釀造條件對模擬葡萄汁/葡萄酒體系中白藜蘆醇含量的影響存在差異。在該研究中，只在模擬葡萄汁體系中添加K2S2O5對白藜蘆醇含量的影響效果更為明顯。在模擬葡萄酒體系中，各因素對模擬體系中白藜蘆醇含量的影響順序為：橡木片＞山梨酸鉀＞明膠＞ K2S2O5＞抗壞血酸＞CaCo3＞皂土＞PVPP＞活性炭。

3 結論

本研究通過單因素實驗分析比較10種釀造工藝條件對模擬葡萄汁及葡萄酒體系中白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響，結果表明，在不同模擬體系下，K2S2O5對白藜蘆醇的穩(wěn)定性影響不同。裝瓶時，山梨酸鉀與抗壞血酸對白藜蘆醇穩(wěn)定性無影響；而鑒于明膠、皂土、PVPP、活性炭等下膠劑的吸附作用，而對白藜蘆醇穩(wěn)定性有較大影響，使得白藜蘆醇含量出現(xiàn)下降趨勢，且不同的下膠劑作用程度不同。CaCO3的降酸作用對白藜蘆醇穩(wěn)定性有較大影響。而橡木片則對白藜蘆醇的穩(wěn)定性無影響或影響輕微。由于該研究只是利用簡單的模擬體系分析測定白藜蘆醇的穩(wěn)定性，然而，未考察真實的葡萄酒或葡萄汁中復雜體系（如單寧、膠體、色素等）對白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響，還有待進一步研究。