殼聚糖季銨鹽和皂土在黑莓果酒澄清中的應(yīng)用

黃自蘇 周劍忠 李亞輝

摘要：采用L9（34）正交試驗(yàn)研究殼聚糖季銨鹽（HACC）用量、皂土用量和澄清作用時(shí)間對(duì)黑莓果酒澄清效果和色度的影響，以果酒澄清度和色度為考核指標(biāo)確定復(fù)合澄清劑澄清處理?xiàng)l件，并通過(guò)測(cè)定復(fù)合澄清劑澄清處理前后黑莓果酒中主要成分含量的變化和熱穩(wěn)定性變化，研究復(fù)合澄清劑對(duì)黑莓果酒的澄清作用。結(jié)果表明，HACC用量 0.3 g/L、皂土用量0.1 g/L、作用時(shí)間3 d為最佳處理?xiàng)l件。在此條件下，復(fù)合澄清劑處理后，果酒中總糖含量、滴定酸含量、乙醇度、有效酸度等變化不顯著，總酚、花色苷和可溶性固形物含量變化顯著（P<0.05）。澄清處理之后，熱穩(wěn)定性有較大提高。說(shuō)明復(fù)合澄清劑是一種良好有效的黑莓果酒澄清劑。

關(guān)鍵詞：黑莓果酒;殼聚糖季銨鹽（HACC）;皂土;澄清度;熱穩(wěn)定性;色度

中圖分類號(hào)： TS262.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0210-03

羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，俗稱殼聚糖季銨鹽（chitosan quaternary ammonium salt，HACC），是從海洋生物中提取的殼聚糖高級(jí)衍生物，一種強(qiáng)陽(yáng)離子型高分子絮凝劑，無(wú)毒無(wú)害，其澄清機(jī)制是通過(guò)電中和與黏結(jié)架橋雙重作用，使溶液中的膠體等雜質(zhì)絮凝沉降，一方面HACC利用自身所帶的大量正電荷與懸浮微粒及膠體所帶的負(fù)電荷相互作用，降低懸浮微粒及膠體表面電荷，使其絮凝脫穩(wěn);另一方面借助于高分子鏈的黏結(jié)架橋作用而產(chǎn)生絮凝。皂土（bentonite）也叫斑脫土，是火山灰分解成的一種黏土，在果酒的pH值條件下，帶有陰離子，具有較好地去除果酒中帶有陽(yáng)離子蛋白的能力[1-4]，是國(guó)內(nèi)外果酒釀造中常用的澄清劑[5-7]。

黑莓（Rubus alleghniensis）含有較高的酚類物質(zhì)和花色苷，具有優(yōu)良的抗氧化、抗癌等功能特性[8-9]，同時(shí)也富含鋅、硒等多種礦物質(zhì)，氨基酸種類也很齊全，被譽(yù)為第3代“黃金水果”。由于黑莓為高酸型水果，口感不佳，但是有較強(qiáng)的加工屬性，黑莓汁、黑莓酒、黑莓醬是主要的加工產(chǎn)品[10-12]。

對(duì)于商品果酒來(lái)說(shuō)，澄清度是決定品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，澄清透明、顏色清亮的果酒商品容易吸引消費(fèi)者的眼球。雖然研究表明渾濁或帶有沉淀的果酒對(duì)人體健康沒有影響，但影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲，進(jìn)而影響銷售市場(chǎng)。因此，果酒必須保持較高的澄清度和穩(wěn)定性。本研究為解決發(fā)酵型黑莓果酒澄清的問題，借鑒前人的研究結(jié)果[13-14]，利用HACC和皂土作為復(fù)合澄清劑對(duì)黑莓果酒的澄清方法進(jìn)行研究，旨在為黑莓酒的澄清方法提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

黑莓果酒由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品工程研究室在2017年1月采用黑莓果汁發(fā)酵釀造而成。黑莓由南京新得力食品有限公司提供，品種為赫爾。發(fā)酵菌種為釀酒酵母FM-S-115，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所保存。澄清劑皂土和HACC購(gòu)于南通綠神生物工程有限公司。

UV-1600 PC型紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司;SK15臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Sigma公司;LC-210.2精密電子天平，購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司;WGZ-800濁度計(jì)，購(gòu)上海昕瑞儀器儀表有限公司;WSC-S測(cè)色色差計(jì)，購(gòu)自上海精科儀器有限公司;HI84532測(cè)定儀，購(gòu)自意大利HANNA;數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，購(gòu)自江蘇省金壇市中正儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑莓果酒釀造 按照以下工藝流程進(jìn)行黑莓果酒釀造：

黑莓果→清洗→打漿→酶解→調(diào)配→發(fā)酵→過(guò)濾除渣。

1.2.2 澄清劑的配制 5%皂土懸浮液的配制：稱取5 g皂土，加入100 mL蒸餾水在50 ℃水浴中軟化，浸泡24 h，攪拌成均勻的漿體。

1% HACC懸浮液的配制：稱取1 g HACC，加入100 mL蒸餾水中，攪拌溶解成均勻的液體。

1.2.3 正交試驗(yàn) 以HACC和皂土為復(fù)合澄清劑處理黑莓果酒，考察復(fù)合澄清劑中HACC和皂土的合適用量和二者之間適宜的配比，同時(shí)考察澄清時(shí)間對(duì)澄清效果的影響。以HACC、皂土用量和澄清作用時(shí)間作為正交試驗(yàn)中的3個(gè)因素，以處理后果酒的濁度值和色度為響應(yīng)值，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，以確定HACC和皂土復(fù)合澄清劑處理黑莓果酒的最優(yōu)化條件，具體設(shè)計(jì)見表1。

1.2.4 濁度值測(cè)量 以蒸餾水調(diào)零，用標(biāo)準(zhǔn)溶液校對(duì)儀器，然后將澄清處理好的果酒倒入試樣瓶中，測(cè)其濁度值，具體操作步驟見儀器使用說(shuō)明書。

1.2.5 色度的測(cè)量 將澄清處理好的果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于420、520、620 nm處測(cè)其吸光度，以三者吸光度之和表示色度[15]。

1.2.6 熱穩(wěn)定性測(cè)定 將澄清處理好的果酒取5 mL置于試管中，置于70 ℃水浴中處理6 h后，取出放置在4 ℃下16 h，然后在室溫下測(cè)定其在540 nm處的吸光度。以樣品熱處理后與熱處理前在540 nm處的吸光度差值表示穩(wěn)定性[16]。

1.2.7 花色苷含量的測(cè)定-pH示差法[17] 取2個(gè)10 mL棕色容量瓶，加入1 mL蒸餾水，分別加入9 mL pH值1.0緩沖液（0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl以體積比為25 ∶ 67進(jìn)行配制）和pH值4.5緩沖液（1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl與H2O以體積比為100 ∶ 60 ∶ 90進(jìn)行配制），搖勻，放置2 h，分別測(cè)定510、700 nm處的吸光度，作為對(duì)照組。測(cè)定樣品時(shí)，將黑莓果酒離心，取1 mL果酒上清液，用蒸餾水稀釋3倍后，按照上述步驟進(jìn)行測(cè)定。花色苷含量按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

花色苷含量（mg/mL）=D×MW×F/（ε×l）。

式中：D=（D510 nm-D700 nm）pH值1.0-（D510nm-D700 nm）pH值4.5;MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，取449.2;F為稀釋倍數(shù);ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，取 26 900;l為比色皿光程，1 cm。

1.2.8 總酚含量的測(cè)定（以沒食子酸計(jì)）-福林酚法（Folin-ciocalteu）[18] 配制質(zhì)量濃度為0、5、10、15、25、50、100 mg/L的沒食子酸溶液，分別取1 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1.5 mL去離子水和0.5 mL Folin-ciocalteu試劑，搖勻后在1 min內(nèi)加入20%（質(zhì)量濃度）Na2CO3溶液 1.5 mL，搖勻后定容至10 mL，20～30 ℃暗處放置2 h，在波長(zhǎng) 765 nm 處測(cè)定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

果酒中總酚含量測(cè)定：取1 mL果酒，用蒸餾水稀釋100倍后按照上述步驟進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算果酒中的總酚含量。

1.2.9 總酸度的測(cè)定 采用HI84532總酸測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟參照儀器使用說(shuō)明書。

1.2.10 可溶性固形物的測(cè)定 采用阿貝折光儀測(cè)定，具體操作步驟見儀器說(shuō)明書。

1.2.11 乙醇度測(cè)定 采用蒸餾乙醇比重法[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2003統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，利用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析確定因素顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合處理對(duì)黑莓果酒澄清度和色度的影響

為了獲得澄清度和穩(wěn)定性較好的黑莓果酒，本研究選擇HACC和皂土作為黑莓果酒的復(fù)合澄清劑，分析HACC用量、皂土用量和澄清作用時(shí)間3個(gè)變量因素對(duì)黑莓果酒澄清度和色澤的影響。以澄清度和色度作為復(fù)合澄清劑處理黑莓果酒效果的考察指標(biāo)，按照表1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表2。從表2中可以看出，3個(gè)因素對(duì)黑莓果酒澄清度的影響大小依次為HACC用量、皂土用量和澄清作用時(shí)間，最佳組合為A3B3C2。對(duì)黑莓果酒色度的影響大小依次為HACC用量、皂土用量和澄清作用時(shí)間，最佳組合為A1B1C1。復(fù)合澄清處理中各因素對(duì)澄清度的方差分析結(jié)果見表3，HACC用量對(duì)黑莓果酒的澄清度影響顯著（P<0.05），皂土用量和澄清作用時(shí)間對(duì)澄清度的影響不顯著。復(fù)合澄清處理中各因素對(duì)黑莓果酒色度的方差分析結(jié)果見表4，HACC用量對(duì)黑莓果酒的色度影響顯著（P<0.05），皂土用量和澄清作用時(shí)間對(duì)色度的影響不顯著。綜合表2、表3和表4的結(jié)果可以看出，HACC用量對(duì)澄清度、色度影響顯著，但在果酒的澄清處理中，除了考慮澄清效果，還要盡量保持果酒原有的色澤，綜合考慮澄清度和色度的處理效率，HACC用量選取A2;本復(fù)合澄清處理過(guò)程中，皂土用量對(duì)澄清度和色度的影響不顯著，取B1;澄清作用時(shí)間對(duì)澄清度和色度的影響都不顯著，同時(shí)考慮生產(chǎn)效率，取C1。綜合分析，本試驗(yàn)較優(yōu)條件為A2B1C1，即使用HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，澄清作用時(shí)間為3 d。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照所得最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行黑莓果酒澄清處理，重復(fù)3次，進(jìn)行驗(yàn)證，澄清處理后黑莓果酒的濁度值為3.64，色度值為1.79。

2.3 澄清劑對(duì)黑莓果酒中主要成分的影響

黑莓果酒經(jīng)復(fù)合澄清劑澄清處理后（HACC用量 0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，處理時(shí)間為3 d）， 果酒中的主要成分變化結(jié)果見表5。復(fù)合澄清劑處理前后，果酒中的總糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度變化不顯著。但是澄清處理對(duì)果酒中的總酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影響顯著（P<0.05）。酚類物質(zhì)是果酒中一類重要組分，其對(duì)果酒的感觀特性包括顏色、風(fēng)味和口感等，具有重要貢獻(xiàn)，同時(shí)也是引起果酒沉淀的一類重要的非生物因素[20-22]。聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）能夠吸附酚類物質(zhì)，在釀酒工業(yè)上被作為澄清劑，能夠降低果酒的渾濁，這表明酚類化合物在果酒沉淀中扮演重要角色[23]。以上結(jié)果表明，復(fù)合澄清劑能夠很好地去除果酒中導(dǎo)致沉底的酚類物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到果酒澄清的目的。

2.4 澄清劑處理前后的熱穩(wěn)定性

將經(jīng)過(guò)復(fù)合澄清劑處理的黑莓果酒放置不同的時(shí)間，測(cè)定其熱穩(wěn)定性，具體結(jié)果見表6。經(jīng)復(fù)合澄清劑處理后的黑莓果酒的熱穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的，沒有經(jīng)過(guò)澄清處理的黑莓果酒在熱處理（70 ℃）后，ΔD540 nm隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間為12個(gè)月時(shí)，澄清處理后果酒的ΔD540 nm為0.002。Marangon等的研究表明，果酒經(jīng)過(guò)熱處理之后，ΔD540 nm值小于0.02，則認(rèn)為果酒的澄清度是穩(wěn)定的，不會(huì)產(chǎn)生渾濁或沉淀[24]。由此可見，黑莓果酒經(jīng)過(guò)HACC和皂土復(fù)合澄清處理后，能保持良好的澄清穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

復(fù)合澄清劑處理黑莓果酒的最佳處理?xiàng)l件為HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，處理時(shí)間為3 d。經(jīng)復(fù)合澄清處理后，果酒中的總糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度變化不顯著，但是澄清處理對(duì)果酒中的總酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影響顯著（P<0.05）。HACC和皂土作為復(fù)合澄清劑處理黑莓果酒，能顯著提高果酒的熱穩(wěn)定性，從而提高了果酒品質(zhì)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lambri M，Dordoni R，Silva A，et al. Effect of bentonite fining on odor-active compounds in two different white wine styles[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2010，61（2）：225-233.