群體感應(yīng)淬滅酶YtnP對草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

趙禎　肖翎　戚建華　劉韻怡　王年　郁小娟　宋增福

摘要：【目的】揭示群體感應(yīng)淬滅作用與宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)間的作用關(guān)系，為具有群體感應(yīng)淬滅作用益生菌及其淬滅酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取30尾規(guī)格為25±1 g/尾的草魚隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組每尾草魚腹腔注射100 μL溶解稀釋后的YtnP（25 μg/mL），對照組每尾草魚腹腔注射等量的300 mmol/L分子篩緩沖液，分別在注射后24和48 h采集草魚前腸、中腸和后腸的腸道組織及內(nèi)容物，提取各腸段總DNA及PCR擴(kuò)增16S rRNA序列V3～V4可變區(qū)，然后基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析外源添加YtnP對草魚腸道菌群多樣性與豐度的影響?！窘Y(jié)果】12份草魚腸道樣品測序共獲得原始序列（Raw reads）660205條，有效序列（Valid reads）416614條;對照組和試驗(yàn)組樣品的OTU數(shù)目分別為142±102和143±67個。在門分類水平上，對照組和試驗(yàn)組草魚腸道優(yōu)勢菌群均為放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）;相對于對照組，試驗(yàn)組草魚腸道中浮霉菌門（Planctomycetes）相對豐度顯著增加（P<0.05，下同），放線菌門、梭桿菌門和變形菌門的相對豐度也呈升高趨勢，但差異不顯著（P>0.05，下同），厚壁菌門、TM7和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度則呈下降趨勢。在屬分類水平上，對照組和試驗(yàn)組草魚腸道均以鯨桿菌屬（Cetobacterium）和諾卡氏菌屬（Nocardia）為優(yōu)勢菌群;相對于對照組，試驗(yàn)組草魚腸道中鯨桿菌屬相對豐度呈升高趨勢、諾卡氏菌屬相對豐度呈下降趨勢，但變化差異均不顯著，未特指微桿菌屬（Unspecified_Microbacteriaceae）相對豐度則顯著增加。草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組樣品的Chao1和ACE指數(shù)低于對照組樣品，Shannon和Simpson指數(shù)略高于對照組樣品，但差異均不顯著;Beta多樣性分析結(jié)果顯示，對照組與試驗(yàn)組間的菌群特點(diǎn)存在差異，且組間區(qū)分效果明顯?！窘Y(jié)論】外源添加YtnP不會導(dǎo)致草魚腸道優(yōu)勢菌群種類發(fā)生明顯變化，但能在一定程度影響腸道菌群的相對豐度。

關(guān)鍵詞： 草魚;群體感應(yīng)淬滅酶;YtnP;腸道菌群;微生態(tài)平衡

中圖分類號： S965.112 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2817-10

Effects of the quorum quenching enzyme YtnP on the intestinal microbiota structure of grass carp（Ctenopharyngodon idellus）

ZHAO Zhen1，2， XIAO Ling1，2， QI Jian-hua1，2， LIU Yun-yi1，2， WANG Nian1，2，

YU Xiao-juan1，2， SONG Zeng-fu1，2，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai，201306， China; 2Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai ?201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai ?201306，China）

Abstract：【Objective】To reveal the relationship between quorum quenching and ?structure of host intestinal microbiota， and to provide a theoretical basis for the promotion and application of quorum quenching probiotics and their quen-ching enzymes in aquaculture. 【Method】Thirty grass carps weighing 25±1 g were randomly set up as ?control group and experimental group. The experimental group was injected with 100 μL YtnP（25 μg/mL） after dissolution and dilution per fish， while the control group was injected with the same amount of 300 mmol/L molecular sieve buffer per fish. The intestinal tissues and contents of fore intestine， mid intestine and hind intestine of grass carp were collected 24 and 48 h after intraperitoneal injection， respectively. Total DNA of each intestinal segment was extracted and the variable region V3-V4 of 16S rRNA sequence was amplified by PCR. The effects of exogenously added YtnP on the diversity and abundance of grass carp intestinal microbiota were analyzed based on Illumina MiSeq high-throughput sequencing. 【Result】A total of 660205 raw reads and 416614 valid reads were obtained from 12 intestinal samples by sequencing. The OTUs of the control and treatment samples were 142±102 and 143±67， respectively. The intestinal microbiota were dominated by Actinobacteria， Fusobacteria，Proteobacteria and Firmicutes ?at the level of phylum in two groups. Compared with the control group，the relative abundance of Planctomycetesin treatment group significantly increased（P<0.05， the same below）， ?Actinobacteria， Fusobacteria，Proteobacteria and Firmicutes also increased， but the difference was not significant（P>0.05， the same below）. The abundance of Firmicutes，TM7 and Bacteroidetes ?showed a decreasing trend. At the level of genus， Cetobacterium and Nocardia were the dominant microbiota in both groups. Compared with the control group， the relative abundance of Cetobacterium and Nocardia in the experimental group showed an increasing trend and a decreasing trend with no significant difference respectively， while abundance of Unspecified_Microbacteriaceae was significantly increased. The Alpha diversity index showed that， Chao1 index and ACE index in treatment group were lower than control group， ?Shannon index and Simpson index were higher than control group， but the difference was not significant. ?Beta diversity analysis showed that there were differences in the characteristics of the microbiota between the two groups， and the difference between the groups was obvious. 【Conclusion】The addition of a single exogenous quorum quenching enzyme YtnP has no obvious effect on the composition of the dominant intestinal microbiota ?in grass carp，but has effect on the relative abundance of intestinal microbiota.

Key words： Ctenopharyngodon idellus; quorum quenching enzyme; YtnP; intestinal microbiota; microecology equilibrium

Foundation item： Shanghai Collaborative Innovation Center Foundation（ZF1206）; “321” Project for Entrepreneu-rial Talents in Nanjing（D-8005-14-0005）

0 引言

【研究意義】草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，也是國內(nèi)養(yǎng)殖量最大的魚類，主要分布在長江、珠江和黑龍江三大水系（沈玉幫等，2011）。草魚幼苗極易感染病原微生物而發(fā)病死亡，抗生素、消毒劑及其他化學(xué)藥品常被用于治療草魚的細(xì)菌性感染（Cabello，2006;Sapkota et al.，2008;Ca?ada-Ca?ada et al.，2009;Nunes et al.，2018），但化學(xué)藥物濫用導(dǎo)致的環(huán)境污染和藥物殘留最終會影響人類健康，且水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域抗生素的濫用及過量使用還會引起細(xì)菌耐藥性問題（Rosa et al.，2018）。因此，亟待探索新的細(xì)菌性病害防治手段以促進(jìn)草魚養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】病原菌的致病作用與其群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）調(diào)控系統(tǒng)密切相關(guān)（Dong et al.，2002;彭孟凡等，2018;童文濤等，2019）。其中，細(xì)菌是通過釋放自誘導(dǎo)信號分子（Autoinducers，AIs）以調(diào)控致病相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響其毒力、黏附和生物膜的形成等（Jiang and Su，2009）。不同種類的AIs介導(dǎo)不同QS系統(tǒng)，阻止AIs積累及其與受體的識別和結(jié)合，可有效抑制QS調(diào)控致病基因的表達(dá)。細(xì)菌存在多種QS系統(tǒng)，其所發(fā)揮細(xì)胞與細(xì)胞間通信作用的信號分子主要分為3種：革蘭氏陰性細(xì)菌的N-?；z氨酸內(nèi)酯（AHLs）、自體誘導(dǎo)分子2（AI-2）和革蘭氏陽性細(xì)菌間自誘導(dǎo)肽（AIPs）（張煉輝，2019）。AHLs是介導(dǎo)革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)中的信號分子，是目前研究較成熟的一類信號分子（Li et al.，2019）。?；z氨酸內(nèi)酯酶能降解AHLs信號分子，阻斷細(xì)菌QS信號通路，導(dǎo)致細(xì)菌致病性及毒力降低或喪失（Dong et al.，2007）。因此，可通過群體感應(yīng)淬滅酶抑制或干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)信號傳導(dǎo)（Dong and Zhang，2005），進(jìn)而阻斷細(xì)菌間的信息交流，抑制毒力基因表達(dá)，降低細(xì)菌致病性（郭冰怡和董燕紅，2018），減緩致病菌耐藥突變體的出現(xiàn)，為解決臨床上過度使用抗生素導(dǎo)致的耐藥性問題提供新路徑。微生物間通過群體感應(yīng)淬滅作用建立細(xì)胞與細(xì)胞間的通信連接，并在微生物間的生態(tài)競爭及動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用（張煉輝，2019）。淬滅酶YtnP作為?；z氨酸內(nèi)酯酶的成員之一，具有與鋅指結(jié)合區(qū)域相似的保守序列HXHXDH和組氨酸殘基，與AiiA同屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶超家族（Barbe et al.，2009）。Schneider等（2012）通過克隆表達(dá)枯草芽孢桿菌YtnP基因而獲得YtnP重組蛋白，并證實(shí)其能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成;此外，鏈霉素能誘導(dǎo)Ytnp基因上調(diào)表達(dá)，YtnP重組蛋白也能抑制灰色鏈霉菌中氣生菌絲和鏈霉素的產(chǎn)生。Traxler和Kolter（2015）研究表明，微生物間通過QS能建立復(fù)雜的作用關(guān)系，且這種作用能進(jìn)一步對細(xì)胞的分化及新陳代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而在整個微生物群落生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生態(tài)功能作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】腸道微生物參與機(jī)體的食物消化、抵抗病原體和免疫系統(tǒng)發(fā)育等過程，在維護(hù)宿主的營養(yǎng)代謝、微生態(tài)平衡與穩(wěn)定及機(jī)體健康等方面發(fā)揮重要作用（Flint et al.，2012;Thaiss et al.，2016;張燕玉等，2019）。本課題組前期從具有群體感應(yīng)淬滅作用的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）T-1株（宋增福等，2015;童文濤等，2019）中提取獲得具有高效群體感應(yīng)淬滅作用的YtnP，且證明其對嗜水氣單胞菌具有顯著的抗感染能力（Chen et al.，2020），但在抗細(xì)菌感染的同時是否對宿主腸道菌群微生態(tài)平衡產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從微生態(tài)菌群平衡與穩(wěn)定的角度出發(fā)，借助高通量測序技術(shù)對草魚腸道微生物群落進(jìn)行16S rRNA測序分析，解析在YtnP作用下腸道菌群多樣性與豐度的變化規(guī)律，進(jìn)一步揭示群體感應(yīng)淬滅作用與宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)間的作用關(guān)系，為具有群體感應(yīng)淬滅作用益生菌及其淬滅酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)草魚由上海市浦東新區(qū)上海海洋大學(xué)濱?？平袒靥峁?，其規(guī)格為25±1 g/尾。試驗(yàn)前暫養(yǎng)于國家水生動物病原庫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，按照體重的1%進(jìn)行投餌，分別于上午8：00和下午16：00定時投喂，養(yǎng)殖水溫控制在（25±2）℃，pH 7.5±0.5。YtnP來源于地衣芽孢桿菌T-1株，經(jīng)原核表達(dá)復(fù)性純化得到Y(jié)tnP融合蛋白，其濃度為150 μg/mL，使用前以300 mmol/L分子篩緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L NaCl，超純水定容至1 L]稀釋至25 μg/mL。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將暫養(yǎng)草魚分為對照組和試驗(yàn)組，每組15尾，每組設(shè)3個平行。試驗(yàn)組草魚每尾注射100 μL溶解稀釋后的YtnP（25 μg/mL），對照組草魚每尾注射等量的300 mmol/L分子篩緩沖液。注射前所有試劑均以0.22 μm的一次性針頭濾器（Millipore）進(jìn)行過濾，具體操作步驟參考彭孟凡（2018）的方法，先對草魚進(jìn)行麻醉，然后進(jìn)行腹腔注射。

1. 3 腸道樣品采集

分別在腹腔注射后24和48 h采集草魚腸道樣品。首先使用75%酒精對草魚體表進(jìn)行消毒，再以無菌PBS沖洗3次，在無菌條件下采集其前腸、中腸和后腸的腸道組織及內(nèi)容物，研磨勻漿后迅速放入液氮速凍，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組解剖6尾草魚。對照組注射后24和48 h采集的樣品分別標(biāo)記為ac1、mc1、pc1、ac2、mc2和pc2;試驗(yàn)組注射后24和48 h采集的樣品分別標(biāo)記為at1、mt1、pt1、at2、mt2和pt2。

1. 4 腸道菌群分析方法及步驟

草魚腸道菌群高通量測序分析委托深圳微生太科技有限公司完成，具體操作步驟如下：

1. 4. 1 樣品基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 使用宏基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。PCR擴(kuò)增采用TransGen AP221-02，反應(yīng)體系20.0 ?L：5×Fast Pfu Buffer 4.0 ?L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 ?L，上、下游引物（5 ?mol/L）各0.8 ?L，F(xiàn)ast Pfu聚合酶0.4 ?L，BSA 0.2 ?L，DNA模板10.0 ng，ddH2O補(bǔ)足至20.0 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，10 ℃結(jié)束反應(yīng)。以細(xì)菌16S rRNA序列V3～V4可變區(qū)為靶標(biāo)，采用帶有Barcode序列的338F/806R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1. 4. 2 上機(jī)測序與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) PCR產(chǎn)物經(jīng)定量分析及文庫構(gòu)建后，利用Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行高通量測序，獲取細(xì)菌16S rRNA序列V3～V4可變區(qū)的堿基序列信息，為保證OTU聚類及后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，所有樣品的全部原始序列信息（Input）均進(jìn)行質(zhì)量控制（Filtered）、去噪（Denoised）和拼接（Merged），并去除嵌合體（Non-chimeric）形成OTU，處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾即得到有效數(shù)據(jù)。

1. 4. 3 數(shù)據(jù)分析 對測序片段進(jìn)行OTU聚類，OTU代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲取OTU對應(yīng)的分類單元（界，門，綱，目，科，屬，種）及其相應(yīng)的豐度信息。計(jì)算Chao1、ACE、Shannon和Simpson等Alpha多樣性指數(shù)，評估樣品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的豐富度和均勻度;綜合應(yīng)用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和AUC（Area under curve）計(jì)算等尋找樣品間及組別間腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性和相似性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 草魚腸道微生物多樣性

12份草魚腸道樣品測序共獲得原始序列（Raw reads）660205條，有效序列（Valid reads）416614條;對照組和試驗(yàn)組樣品的OTU數(shù)目分別為142±102和143±67個。每樣品的原始序列、有效序列及OTU數(shù)目詳見表1。對照組樣品中OTU數(shù)目最高的是ac1（244個）、最低的是pc1（67個）;試驗(yàn)組樣品中OTU數(shù)目最高的是at1（210個）、最低的是pt1（105個）。各樣品在界、門、綱、目、科、屬及種分類水平上的OTU數(shù)目分布情況如圖1所示。

2. 2 草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)及其相對豐度

選取在門分類水平上相對豐度排名前10的菌群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表2）顯示，對照組樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門類分別是放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、TM7和擬桿菌門（Bacteroidetes），其他門類占總序列數(shù)目比例均不足1.00%;試驗(yàn)組樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門類分別是放線菌門、梭桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、TM7和浮霉菌門（Planctomycetes），其他門類占總序列數(shù)目的比例均不足1.00%。相對于對照組，試驗(yàn)組草魚腸道中浮霉菌門相對豐度顯著增加（P<0.05，下同），放線菌門、梭桿菌門、變形菌門和綠灣菌門（Chloroflexi）的相對豐度也呈升高趨勢，但差異不顯著（P>0.05，下同），厚壁菌門、TM7、擬桿菌門、衣原體門（Chlamydiae）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度則呈下降趨勢。不同腸段樣品菌群結(jié)構(gòu)的相對豐度在門分類水平上也存在一定差異，主要表現(xiàn)為：草魚前腸和中腸的放線菌門相對豐度較高，而后腸相對較低;草魚中腸和后腸的梭桿菌門相對豐度較高，而前腸相對較低;對照組草魚前腸和后腸的厚壁菌門相對豐度較高，但試驗(yàn)組草魚各腸段的厚壁菌門相對豐度均較低（圖2）。

選取在屬分類水平上相對豐度排名前10的菌群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表3）表明，對照組樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬類分別是鯨桿菌屬（Cetobacterium）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、未特指消化鏈球菌屬 （Unspecified_Peptostreptococcaceae）、勞森菌屬（Lawsonia）、紅桿菌屬（Rhodobacter）、Unspecified_TM7_3和未特指根瘤菌屬（Unspecified_Rhizobiales），其他屬類占總序列數(shù)目比例均不足1.00%。試驗(yàn)組樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬類分別是鯨桿菌屬、諾卡氏菌屬、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、未特指根瘤菌屬、未特指微桿菌屬（Unspecified_Microbacteriaceae）、紅桿菌屬和紅球菌屬（Rhodococcus），其他屬類占總序列數(shù)目比例均不足1.00%。相對于對照組，試驗(yàn)組草魚腸道中鯨桿菌屬、未特指根瘤菌屬、分枝桿菌屬、未特指微桿菌屬和紅球菌屬的相對豐度均呈升高趨勢，其中未特指微桿菌屬相對豐度顯著增加;諾卡氏菌屬、未特指消化鏈球菌屬、紅桿菌屬、勞森菌屬和Unspecified_TM7_3的相對豐度則呈下降趨勢，差異均不顯著。不同腸段樣品菌群結(jié)構(gòu)的相對豐度在屬分類水平上也存在差異，主要表現(xiàn)為：草魚中腸和后腸的鯨桿菌屬相對豐度較高，而前腸相對較低;草魚前腸和中腸的諾卡氏菌屬相對豐度較高，而后腸相對較低;對照組草魚前腸和后腸的未特指消化鏈球菌屬相對豐度較高，但試驗(yàn)組草魚各腸段的未特指消化鏈球菌屬相對豐度均較低（圖3）。

為進(jìn)一步探究不同樣品間的差異性和相似性，選取屬分類水平的物種（取相對豐度排名前20的物種）進(jìn)行樣品聚類分析并繪制相應(yīng)的熱圖。由圖4可看出，與對照組樣品相比，試驗(yàn)組樣品中的未特指消化鏈球菌屬相對豐度呈下降趨勢，而未特指根瘤菌屬、分支桿菌屬、未特指微桿菌屬和Kaistia屬相對豐度呈上升趨勢。

2. 3 草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)Alpha多樣性分析結(jié)果

Alpha多樣性通常用于度量群落生態(tài)系統(tǒng)中物種的豐富度，是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)（洪嘉煒等，2019）。其中，Chao1和ACE指數(shù)用于評估樣品菌群中所含的OTU數(shù)目;Shannon指數(shù)用于評估樣品中物種組成的豐富度和均勻度，數(shù)值越大表示物種越豐富、分配越均勻;Simpson指數(shù)用于估算樣品中微生物的多樣性，指數(shù)值越大說明其群落多樣性越低（馮士彬等，2019）。由圖5可看出，試驗(yàn)組樣品的Chao1和ACE指數(shù)低于對照組樣品，Shannon和Simpson指數(shù)略高于對照組樣品，但差異均不顯著。Alpha多樣性稀釋曲線是以O(shè)TU數(shù)目為縱坐標(biāo)、測序數(shù)量為橫坐標(biāo)，用于表征樣品測序結(jié)果是否合理，同時能間接反映樣品中的物種豐度。由圖6可看出，當(dāng)測序數(shù)量>20000時，Alpha多樣性稀釋曲線趨于平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所含的物種多樣性。

2. 4 草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析結(jié)果

PCA分析主要是探究不同處理?xiàng)l件下各樣品可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，可反映出樣品間的關(guān)系及個體或群體間的差異。本研究的PCA分析結(jié)果（圖7-A）顯示，對照組個別樣品點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，說明這些樣品間的菌群結(jié)構(gòu)差異較明顯;試驗(yàn)組各樣品點(diǎn)聚集相對緊密，說明各樣品間的菌群結(jié)構(gòu)差異較小，且與對照組樣品間也存在一定差異。PLS-DA分析是忽略組內(nèi)的隨機(jī)差異，而重點(diǎn)突出組間的系統(tǒng)差異，且能選擇性忽略分組間無差異的物種。PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組草魚腸道菌群與對照組草魚腸道菌群間存在系統(tǒng)差異（圖7-B）。AUC被定義為ROC曲線下與坐標(biāo)軸圍成的面積。AUC越接近于1，說明分組間的區(qū)分效果越好，即有多個微生物在分組間的豐度存在差異。由圖7-C可看出，Control∶Treatment=1，表明對照組與試驗(yàn)組的草魚腸道菌群區(qū)分效果明顯。

3 討論

腸道微生物種類繁多、數(shù)目巨大，通過與宿主共同進(jìn)化而長期生存，且與宿主間形成相對穩(wěn)定的互利互惠共生關(guān)系（Ley et al.，2008）。在魚類腸道微生態(tài)系統(tǒng)中，變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門等構(gòu)成了腸道優(yōu)勢菌群（Li et al.，2014）;在宿主的生長發(fā)育過程中，常因飼料、藥物和外界環(huán)境等因素的介入而影響其腸道菌群組成（Parshukov et al.，2019），致使腸道菌群結(jié)構(gòu)處于動態(tài)變化之中。本研究結(jié)果表明，外源添加YtnP對草魚腸道菌群在不同分類水平上均有一定影響。在門分類水平上，外源添加YtnP后，草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)組成未發(fā)生顯著變化，變形菌門、梭桿菌門和放線菌門仍為優(yōu)勢菌群，但其相對豐度呈升高趨勢。李勝利（2016）研究發(fā)現(xiàn)，添加YtnP后綿羊瘤胃中的放線菌門相對豐度呈升高趨勢，且顯著增加互養(yǎng)菌門（Synergistetes）和降低軟壁菌門（Tenericutes）的相對豐度，表明YtnP對魚類及哺乳動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)均具有一定調(diào)節(jié)作用;但與Zhou等（2016）采用具有產(chǎn)群體感應(yīng)淬滅酶能力的枯草芽孢桿菌QSI-1飼喂金魚的試驗(yàn)結(jié)果存在差異，究其原因可能是群體感應(yīng)淬滅酶較具有產(chǎn)生群體感應(yīng)淬滅作用的益生菌，對機(jī)體腸道菌群的調(diào)節(jié)作用更直接且迅速。

本研究在分析門分類水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較屬分類水平上草魚腸道菌群相對豐度的變化情況。結(jié)果顯示，鯨桿菌屬和諾卡氏菌屬是草魚腸道的主要優(yōu)勢菌群，同時存在未特指消化鏈球菌屬、勞森菌屬、未特指TM7-3、紅球菌屬及未特指微桿菌屬等優(yōu)勢菌屬。鯨桿菌屬具有高效的產(chǎn)維生素B12及代謝碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、乳酸和琥珀酸等能力（Parshukov et al.，2019）;微桿菌屬可產(chǎn)生多種抗菌成分，抑制多種病原菌生長（劉凌燕等，2018）;紅球菌屬能有效利用源自有機(jī)化合物的能源和碳源，降解石油烴、腈化物和霉菌毒素，并產(chǎn)特殊的類胡蘿卜素（邱孜博等，2016）。外源添加YtnP后，草魚腸道微桿菌屬、鯨桿菌屬和紅球菌屬的相對豐度均呈增加趨勢，表明YtnP能調(diào)節(jié)宿主腸道菌群，且呈現(xiàn)出有利于維護(hù)草魚腸道營養(yǎng)代謝和增強(qiáng)抗病力的作用。此外，能引起慢性疾病的分枝桿菌屬也呈上升趨勢，但具體原因有待進(jìn)一步探究。雖然外源添加YtnP對草魚腸道優(yōu)勢菌群并未產(chǎn)生顯著影響，但是否對機(jī)體的抗病力和營養(yǎng)代謝產(chǎn)生影響，還需從更長時間維度及設(shè)不同給藥濃度等因素進(jìn)一步研究YtnP對腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡的影響。

群體感應(yīng)淬滅機(jī)制是通過降解信號分子、產(chǎn)生信號分子結(jié)構(gòu)類似物及阻斷信號分子與受體結(jié)合等途徑來實(shí)現(xiàn)（Roy et al.，2011）。YtnP作為外源添加的單一?；z氨酸內(nèi)酯酶能改變草魚腸道菌群相對豐度，其實(shí)現(xiàn)途徑可能是：（1）基于AHLs信號分子為靶向的淬滅途徑導(dǎo)致腸道菌群豐度改變。已有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體腸道菌群浮霉菌門中的厭氧氨氧化菌（Anammox bacteria）存在AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)（de Cloppeleir et al.，2011;Zhao et al.，2016）;也有研究證實(shí)革蘭氏陽性菌MPO（GenBank登錄號JF915892，厚壁菌門成員）具有產(chǎn)AHLs能力（Biswa and Doble，2013），但AHLs是否由多數(shù)厚壁菌門成員產(chǎn)生尚無報(bào)道。YtnP對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響可能是通過對AHLs的淬滅作用導(dǎo)致群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的生理機(jī)能發(fā)生改變，減少或增加細(xì)菌生理代謝產(chǎn)物，造成群落中的細(xì)菌生態(tài)競爭能力差異化，最終導(dǎo)致草魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)和比例發(fā)生改變。因此，對于浮霉菌門相對豐度顯著上升現(xiàn)象，可能是由于群體感應(yīng)淬滅作用解除了AHLs的抑制作用，從而導(dǎo)致其相對豐度顯著升高。（2）與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌間存在種間信號分子AI-2途徑有關(guān)。AI-2是細(xì)菌種間的交流信號分子（Li et al.，2019）。Thompson等（2015）發(fā)現(xiàn)，腸道菌群經(jīng)鏈霉素處理后厚壁菌門的相對豐度顯著降低，而添加產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子AI-2的大腸桿菌后，腸道厚壁菌門相對豐度有所回升。本研究結(jié)果表明，外源添加YtnP與添加鏈霉素具有同樣的作用，能降低草魚腸道厚壁菌門相對豐度。因此，推測種間信號分子AI-2與YtnP對厚壁菌門細(xì)菌的調(diào)節(jié)作用存在相關(guān)性，可為揭示腸道菌群間復(fù)雜的生態(tài)關(guān)系提供新思路。

4 結(jié)論

外源添加YtnP不會導(dǎo)致草魚腸道優(yōu)勢菌群種類發(fā)生明顯變化，但能在一定程度影響腸道菌群的相對豐度。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-02-29

基金項(xiàng)目：上海市協(xié)同創(chuàng)新中心基金項(xiàng)目（ZF1206）;南京創(chuàng)業(yè)人才“321”計(jì)劃項(xiàng)目（D-8005-14-0005）

作者簡介：*為通訊作者，宋增福（1971-），博士，副教授，主要從事水產(chǎn)病害防控技術(shù)研究工作，E-mail：zfsong@shou.edu.cn。趙禎（1996-），研究方向?yàn)樗鷦游镂⑸鷳B(tài)學(xué)，E-mail：251070057@qq.com