Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

叢豪　羅寧　黃飛　梁月昭　陳碩昌　張聲峰　朱萍　楊輝

摘要：【目的】從耐熱菌株中克隆表達(dá)左聚糖蔗糖酶基因，以獲得熱穩(wěn)定性較好、底物耐受性高的重組酶，為左聚糖蔗糖酶催化機(jī)理及生產(chǎn)應(yīng)用研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。【方法】從市售菌肥中篩選耐熱菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因，以pSE380為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，隨后通過(guò)鎳親和層析獲得電泳純的重組左聚糖蔗糖酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)?！窘Y(jié)果】分離到耐熱菌株LN-05，經(jīng)16S rDNA序列分析鑒定為Bacillus paralicheniformis?？寺”磉_(dá)的B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶與已公布地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19個(gè)氨基酸殘基差異。重組酶催化水解反應(yīng)最適pH為6.0，最適溫度為45 ℃，于40和45 ℃保溫3 h后殘余酶活力分別為89%和78%。Mn2+、Ag3+和Cr2+對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的水解活力有明顯抑制作用，Co2+和Al3+對(duì)水解活力具有一定促進(jìn)效果;Ba2+、Mg2+和Mn2+對(duì)聚合活力有明顯抑制作用，Ag3+、Cu2+和K+對(duì)聚合活力具有促進(jìn)作用。EDTA對(duì)重組酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用。在最適條件下，重組左聚糖蔗糖酶的最大反應(yīng)速率（Vmax）=74 μmol/（min·mg），米氏常數(shù)（Km）為7.57 mmol/L。催化聚合反應(yīng)的最適溫度隨著底物蔗糖濃度而變化，當(dāng)蔗糖濃度為50%時(shí)，最適溫度為40 ℃;最適聚合反應(yīng)pH為5.0;當(dāng)酶濃度為0.9 U/mL，在最適條件下反應(yīng)24 h，左聚糖產(chǎn)糖量達(dá)183.00±1.73 g/L，蔗糖轉(zhuǎn)化率為（36.76±1.84）%。【結(jié)論】B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的熱穩(wěn)定性較好，左聚糖產(chǎn)量高，具有轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)高附加值左聚糖的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： Bacillus paralicheniformis;左聚糖蔗糖酶;克隆表達(dá);酶學(xué)性質(zhì);熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： S188.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）11-2808-09

Cloning，expression and enzymatic properties of the levansucrase gene from Bacillus paralicheniformis

CONG Hao1，2， LUO Ning1， HUANG Fei1， LIANG Yue-zhao1， CHEN Shuo-chang1，

ZHANG Sheng-feng1， ZHU Ping1， YANG Hui1，2，3*

（1College of Life Sciences and Technology， Guangxi University， Nanning ?530004， China; 2Guangxi Research Center for Microbial and Enzyme Engineering Technology， Nanning ?530004， China; 3State Key Laboratory for

Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning ?530004， China）

Abstract：【Objective】Cloning and expressing of a levansucrase gene from heat-resistant strains in order to obtain a recombinant enzyme with good thermal stability and high substrate tolerance，which would provide basis for the study on catalytic mechanism and levansucrase production. 【Method】Heat-resisting strain was screened from commercial fertilizer. Then the gene of levansucrase was cloned. With pSE380 as vector， ?recombinant plasmid was constructed and transformed into Escherichia coli induced expression. Then electrophoresis pure recombinant levosucrase was obtained by nickel affinity chromatography and its enzymatic properties were studied. 【Result】A heat-resistant strain LN-05 was isola-ted and identified as Bacillus paralicheniformis by 16S rDNA sequencing analysis. B. paralicheniformis levansucrase was then cloned and expressed， which had nineteen amino acid residues difference from the B. licheniformis RN-01 levansucrase previously reported. The enzymatic properties showed that the optimum pH of hydrolysis reaction was 6.0，the optimum temperature was 45 ℃. The residual activity were 89% and 78% of the enzyme incubated for 3 h at 40 and 45 ℃，respectively. The presence of Mn2+，Ag3+ and Cr2+ inhibited hydrolytic activities while Co2+ and Al3+showed positive effects. Ba2+，Mg2+ and Mn2+ had inhibitory effect on the polymerization activities， while Ag3+，Cu2+ and K+had positive effects. EDTA had an inhibitory effect on both recombinant enzyme hydrolysis activity and recombinant enzyme polymerization activity. Under the optimal conditions，the maximum reaction rate（Vmax） of the recombinant levansucrase was Vmax=74 μmol/（min·mg），Michaelis constant（Km）=7.57 mmol/L. The optimum temperature of polymerization reaction varied with the sucrose substrate concentration. The optimum temperature was 40 ℃ at the sucrose concentration of 50%， and its optimum polymerization pH was 5.0. Reacted with 0.9 U/mL enzyme under this optimum condition for 24 h， the amount of the produced levan reached about 183.00±1.73 g/L and the conversion yieldwas（37.76±0.80）%. 【Conclusion】The obtained B. paralicheniformis levansucrase has fine thermal stability and high levan yield， and has the potential to ?transform sucrose to high value-added levan.

Key words： Bacillus paralicheniformis; levansucrase; cloning and expression; enzymatic properties; thermal stability

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198128）; Science Research and Techno-logy Development Project of Nanning（20141015）

0 引言

【研究意義】左聚糖是一種由果糖基組成的多糖，其純品為白色粉末，無(wú)味、能溶于水或水的混合溶劑，不溶脹、不形成凝膠，具有假塑性（Bae et al.，2008）;此外，其化學(xué)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，有一定的溫度穩(wěn)定性（Barone and Medynets，2007）。左聚糖具有廣泛的應(yīng)用范圍和良好的市場(chǎng)前景（Li et al.，2015），在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有抗腫瘤活性（Yoo et al.，2004），在食品行業(yè)具有益生作用（Korakli et al.，2003），且廣泛應(yīng)用于其他商業(yè)非酒精飲料（Bello et al.，2001）。左聚糖蔗糖酶屬于GH68糖苷水解酶家族，可催化蔗糖發(fā)生水解和聚合2種主要反應(yīng)，其中聚合反應(yīng)可將蔗糖轉(zhuǎn)化為高附加值的左聚糖。廣西甘蔗資源豐富，但行業(yè)產(chǎn)品種類較少，缺乏高附加值的蔗糖深加工產(chǎn)品，易受國(guó)外糖制品和甜味劑沖擊，限制了蔗糖工業(yè)的發(fā)展（侯佳，2014）。左聚糖蔗糖酶是利用蔗糖生產(chǎn)左聚糖的關(guān)鍵酶，具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，通過(guò)克隆表達(dá)新的高性能左聚糖蔗糖酶，并優(yōu)化聚合反應(yīng)條件，提高蔗糖的轉(zhuǎn)化率，對(duì)將來(lái)規(guī)模生產(chǎn)左聚糖具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前制備左聚糖的方法主要有4種，分別為從植物中提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵和酶法合成（王涵等，2009）。相對(duì)而言，酶法合成左聚糖具有制備方法簡(jiǎn)單、純化方便、產(chǎn)量較高等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，左聚糖的研究熱點(diǎn)主要集中在細(xì)菌產(chǎn)左聚糖的生物合成及其應(yīng)用的多樣性（Ortiz-Soto et al.，2019）。已有研究表明，不同微生物來(lái)源左聚糖蔗糖酶的酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)物性質(zhì)有所不同（Srikanth et al.，2015;González-Garcinu et al.，2017）。多數(shù)已報(bào)道的左聚糖蔗糖酶催化聚合反應(yīng)的熱穩(wěn)定性欠佳（Han et al.，2009;Xu et al.，2018）。Méndez-Lorenzo等（2015）研究證實(shí)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）的左聚糖蔗糖酶產(chǎn)左聚糖溫度為25 ℃。已有報(bào)道中，蔗糖轉(zhuǎn)化率較高的是來(lái)自地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）的左聚糖蔗糖酶，其在10%底物濃度時(shí)轉(zhuǎn)化率可達(dá)40%以上（陸娟等，2013）;但也有研究表明左聚糖蔗糖酶在高底物濃度下左聚糖合成減弱，而制約其生產(chǎn)應(yīng)用（Lorenzetti et al.，2015;?ner et al.，2016）。例如一種納豆芽孢桿菌（B. subtilis natto）左聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度超過(guò)25%以上時(shí)則不利于聚合反應(yīng)（Bersaneti et al.，2018）。【本研究切入點(diǎn)】從耐熱微生物中克隆獲得熱穩(wěn)定性好、耐高底物濃度且轉(zhuǎn)化率高的左聚糖蔗糖酶是提高左聚糖產(chǎn)量的關(guān)鍵，但目前同時(shí)具備這3種性質(zhì)的左聚糖蔗糖酶較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)基因工程和酶工程的方法，獲得熱穩(wěn)定性好、且在50%高底物濃度下蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)35%以上的左聚糖蔗糖酶，從而為提高左聚糖生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

Bacillus paralicheniformis LN-05由廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室從市售菌肥中篩選獲得并保存，大腸桿菌（Escherichia coli）XL-10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，質(zhì)粒pSE380購(gòu)自Invitrogen公司。Eazy Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司，T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（PstⅠ、NcoⅠ）、λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker、DL2000 DNA Marker、蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量和dNTPs均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、柱式膠回收試劑盒和柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母粉和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB瓊脂平板：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15 g/L。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌株16S rDNA序列分析 鑒定提取待測(cè)菌基因組，通過(guò)通用引物擴(kuò)增其16S rDNA序列（Erden-Karao?lan et al.，2019），送至廣州華大基因科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 2. 2 左聚糖蔗糖酶克隆 根據(jù)已公開(kāi)的地衣芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶基因序列（Nakapong et al.，2013）設(shè)計(jì)引物（F-primer：5'-GATCCATGGTGAAC ATCAAAAACATTGCTAAAAAAGCGTCAGCCTT AACCGCG-3'，R-primer：5'-CGCGCTGCAGTTAAT GATGATGATGATGATGTTTGTTTACCGTTAGTT TCCCTG-3'），其中下游引物加入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。以目的菌全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：DNA 1.0 ng，上、下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，Easy Taq DNA聚合酶0.8 μL，10×Easy Taq Buffer 5.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，進(jìn)行24個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。

1. 2. 3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 擴(kuò)增獲得的左聚糖蔗糖酶基因產(chǎn)物經(jīng)柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，再以NcoⅠ和PstⅠ雙酶切處理后，連接到經(jīng)相同雙酶切的原核表達(dá)載體pSE380上，得到含目的基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化XL-10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性重組菌送至廣州華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)分析。

1. 2. 4 重組左聚糖蔗糖酶表達(dá) 將含有pSE380-Lev重組質(zhì)粒的XL-10重組菌株接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過(guò)夜活化，次日以1%～2%的接種量轉(zhuǎn)接到含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min培養(yǎng)3～4 h;當(dāng)OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)加入終濃度0.8 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于24 ℃下220 r/min誘導(dǎo)產(chǎn)酶18 h。

1. 2. 5 重組左聚糖蔗糖酶純化 取1 L重組左聚糖蔗糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)液，8000 r/min離心15 min，收集菌體，用ddH2O重懸清洗，再用相同條件離心，用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸細(xì)胞置于冰水浴，超聲波39 W 1 h，間或5 s工作破胞，破胞液經(jīng)12000 r/min離心15 min，取上清液。用鎳柱純化方式進(jìn)行提純操作（Hernandez et al.，1995），洗脫液樣品采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1. 2. 6 重組左聚糖蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1. 2. 6. 1 水解活力測(cè)定 用DNS法（楊輝，2012）測(cè)定左聚糖蔗糖酶水解活力。1個(gè)酶活力單位（U）定義為：在最適溫度和pH條件下，1 min催化蔗糖轉(zhuǎn)化為1 μmol葡萄糖所需左聚糖蔗糖酶的量（Belghith et al.，2012），以各反應(yīng)條件下最大活力值為100%計(jì)算相對(duì)活力。

1. 2. 6. 2 聚合活力測(cè)定 取490 μL含適當(dāng)濃度蔗糖的50 mmol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液（pH 5.0），加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液10 μL，在所需溫度下溫浴反應(yīng)24 h后取出;在反應(yīng)體系中加入3倍體積無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，4 ℃靜置24 h后，12000 r/min離心25 min;用蒸餾水重懸沉淀，再次離心，直至用DNS顯色法檢測(cè)上清液無(wú)還原糖殘留。所得左聚糖沉淀烘干至恒重稱量，計(jì)算蔗糖轉(zhuǎn)化率和左聚糖產(chǎn)量，以各反應(yīng)條件下最高產(chǎn)量值為100%計(jì)算相對(duì)活力。

1. 2. 6. 3 水解反應(yīng)最適溫度和最適pH測(cè)定 將純化的酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)（稀釋至適合檢測(cè)的濃度范圍），分別在25～55 ℃下反應(yīng)測(cè)定最適溫度;同時(shí)在pH 3.5～7.0的緩沖液中反應(yīng)測(cè)定最適pH。

1. 2. 6. 4 水解活力的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測(cè)定

將重組左聚糖蔗糖酶保溫在不同溫度（40～55 ℃）下，每隔30 min取樣在最適溫度下測(cè)定酶活力，考察熱穩(wěn)定性。在pH 3.5～7.0的一系列梯度緩沖液中水浴30 min，以最適pH和溫度下的酶活力為參照，確定其pH穩(wěn)定性。

1. 2. 6. 5 金屬離子和EDTA對(duì)水解活力的影響 以pH 6.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液為對(duì)照，分別用含終濃度為2.5mmol/L的Cr3+、Co2+、Ag3+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Al3+、K+、Mn2+和Fe2+緩沖液及含有0～120 mmol/L不同梯度的EDTA緩沖液稀釋重組左聚糖蔗糖酶，于4 ℃下放置12 h后按標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活力。

1. 2. 6. 6 水解活力的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 采用雙倒數(shù)作圖法制作Linewaver-Burk曲線，求出水解反應(yīng)的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）。

1. 2. 6. 7 聚合反應(yīng)的最適溫度和最適pH測(cè)定 將磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液分別在25～55 ℃的水浴鍋內(nèi)保溫5 min后，在對(duì)應(yīng)溫度下反應(yīng)24 h后按照乙醇提取法獲得左聚糖（Santos-Moriano et al.，2015），測(cè)定最適溫度。在pH 3.5～7.5的緩沖液保溫30 min，測(cè)定最適pH。

1. 2. 6. 8 聚合活力的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性 將重組左聚糖蔗糖酶保溫在不同溫度（35～50 ℃）下，每隔30 min取樣并反應(yīng)24 h，在最適pH和溫度下考察其熱穩(wěn)定性。將重組左聚糖蔗糖酶在pH 3.5～7.5的緩沖液中保溫30 min，在最適pH和溫度下確定其pH穩(wěn)定性。

1. 2. 6. 9 不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)聚合活力的影響 以pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液為對(duì)照，分別用含終濃度為2.5 mmol/L的Cr3+、Co2+、Ag3+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Al3+、K+、Mn2+和Fe2+緩沖液及含0～120 mmol/L不同梯度的EDTA緩沖液稀釋重組左聚糖蔗糖酶，4 ℃放置12 h后，在最適pH和溫度下考察金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)其聚合活力的影響。

1. 2. 6. 10 蔗糖濃度、酶濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)聚合活力的影響 用50 mmol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液（pH 5.0）配制10%～50%的蔗糖溶液，重組左聚糖蔗糖酶濃度0.8 U/mL，35 ℃下保溫5 min后反應(yīng)24 h，測(cè)定底物濃度對(duì)重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的影響;在最適底物濃度和酶濃度條件下，將反應(yīng)液35 ℃保溫5 min，反應(yīng)4～40 h后提取左聚糖，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)其聚合活力的影響;在最適底物濃度和35 ℃條件下保溫5 min，分別加入0.3～1.5 U/mL的重組左聚糖蔗糖酶反應(yīng)24 h后，測(cè)定酶濃度對(duì)其聚合活力的影響。

1. 2. 6. 11 不同溫度和底物蔗糖濃度對(duì)左聚糖蔗糖酶的影響 取蔗糖濃度20%～50%的緩沖液在35～50 ℃下反應(yīng)24 h，測(cè)定重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以O(shè)rigin 8.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株 LN-05的16S rDNA序列分析結(jié)果

從菌肥中分離出的菌株LN-05經(jīng)16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖1），結(jié)果表明，菌株LN-05的16S rDNA序列與目前已公布B. paralicheniformi Bac48（Dunlap et al.，2015）的16S rDNA序列相似性達(dá)99.7%，可初步鑒定該菌株為B. paralicheniformis。

2. 2 重組左聚糖蔗糖酶基因克隆、表達(dá)及純化結(jié)果

從菌株LN-05基因組中擴(kuò)增左聚糖蔗糖酶基因，得到大小約1400 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。經(jīng)廣州華大基因科技有限公司測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與已公布地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19個(gè)氨基酸殘基差異（圖3）。重組酶誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鎳親和層析純化再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示，重組蛋白分子量約53 kD，與理論值53.8 kD較符合。

2. 3 重組左聚糖蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果

2. 3. 1 溫度對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖5可知，重組左聚糖蔗糖酶以蔗糖為底物的水解反應(yīng)最適溫度為45 ℃，溫度超過(guò)50 ℃后水解活力快速下降。而底物濃度為20%時(shí)的聚合反應(yīng)最適溫度為35 ℃，當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃后，聚合活力逐步下降。由于該重組酶的水解與聚合反應(yīng)機(jī)制有差異，故其最適反應(yīng)溫度并不一致，高溫下聚合反應(yīng)減弱，更傾向水解反應(yīng)。

2. 3. 2 pH對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖6可知，重組左聚糖蔗糖酶水解反應(yīng)的最適pH為6.0，當(dāng)pH大于6.0時(shí)其水解活力快速下降;聚合反應(yīng)的最適pH為5.0，當(dāng)pH大于5.0時(shí)隨著pH的升高，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力不斷下降，當(dāng)pH達(dá)7.5時(shí)，左聚糖產(chǎn)量?jī)H為18.73±0.73 g/L。

2. 3. 3 重組左聚糖蔗糖酶的熱穩(wěn)定性 由圖7-A可知，重組左聚糖蔗糖酶的水解活力在40和45 ℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性，保溫3 h的殘余酶活力分別仍有89%和78%;當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，該酶的熱穩(wěn)定性較差。由圖7-B可知，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力在35 ℃時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性，保溫3 h后殘余酶活力為74%，40 ℃時(shí)聚合活力半衰期仍保持在45 min左右。

2. 3. 4 重組左聚糖蔗糖酶的pH穩(wěn)定性 由圖8可知，重組左聚糖蔗糖酶水解活力在pH 4.5～6.0范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性，當(dāng)pH大于6.0時(shí)pH穩(wěn)定性較差，且隨著pH不斷升高，水解活力的pH穩(wěn)定性快速下降;當(dāng)pH為5.0時(shí)，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力具備較好的pH穩(wěn)定性，當(dāng)pH大于5.0時(shí)隨著pH的升高其穩(wěn)定性逐漸變差，當(dāng)pH達(dá)7.5時(shí)左聚糖產(chǎn)量?jī)H為8.78±0.70 g/L。

2. 3. 5 金屬離子對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖9可知，Mn2+、Ag3+和Cr3+對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的水解活力有明顯抑制作用，而Co2+和Al3+具有促進(jìn)作用，水解活力較對(duì)照分別提高14%和11%;Ag3+、Cu2+和K+對(duì)重組左聚糖蔗糖酶聚合活力具有一定的促進(jìn)作用，Ba2+、Mg2+和Mn2+則具有明顯的抑制作用，分別抑制聚合活力32%、28%和34%。

2. 3. 6 EDTA對(duì)重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖10可知，隨著EDTA濃度的增加，重組左聚糖蔗糖酶的水解活力和聚合活力均不斷下降，EDTA濃度達(dá)120 mmol/L時(shí)的水解活力為58.09±0.03 U/mL，下降了66%;左聚糖產(chǎn)量為73.69±0.31 g/L，下降了66.2%。說(shuō)明重組左聚糖蔗糖酶需要金屬離子激活。

2. 3. 7 重組左聚糖蔗糖酶的Linewaver-Burk圖 通過(guò)Linewaver-Burk雙倒數(shù)作圖（圖11），得到米氏擬合方程為y=0.14565x+0.01351（R?=0.9927），Vmax=74 μmol/（min·mg），Km為7.57 mmol/L，表明該重組左聚糖蔗糖酶具有較快的反應(yīng)速度和較好的底物親和性。

2. 3. 8 底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和酶濃度對(duì)重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的影響 底物蔗糖濃度明顯影響左聚糖的合成，本研究的重組左聚糖蔗糖酶對(duì)底物濃度耐受性較高，由圖12-A可知，當(dāng)蔗糖濃度為50%時(shí)，重組左聚糖蔗糖酶聚合活力最高，左聚糖產(chǎn)量達(dá)176.00±0.80 g/L;當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%，最適pH條件下的最適反應(yīng)時(shí)間為24 h（圖12-B），最適聚合反應(yīng)的酶濃度為0.9 U/mL（圖12-C）。在最適聚合反應(yīng)條件（50%蔗糖溶液、酶濃度0.9 U/mL、35 ℃、pH 5.0、反應(yīng)24 h）下其蔗糖轉(zhuǎn)化率為（36.60±0.80）%，左聚糖產(chǎn)量為183.20±4.10 g/L。

2. 3. 9 不同溫度和蔗糖濃度對(duì)重組左聚糖蔗糖酶聚合活力及轉(zhuǎn)化率的影響 底物濃度影響重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的耐熱性，當(dāng)蔗糖濃度為20%～40%時(shí)，其最適聚合反應(yīng)溫度為35 ℃，而蔗糖濃度達(dá)50%時(shí)的最適聚合反應(yīng)溫度上升至40 ℃，此時(shí)左聚糖產(chǎn)量達(dá)最大值，為183.00±1.73 g/L（圖13-A），并保持較高的轉(zhuǎn)化率（36.76±1.84）%（圖13-B）。說(shuō)明底物濃度較高時(shí)可對(duì)重組左聚糖蔗糖酶起到一定的保護(hù)作用。但從蔗糖轉(zhuǎn)化率來(lái)看，底物濃度40%、35 ℃反應(yīng)時(shí)可達(dá)最高轉(zhuǎn)化率，為（39.80±2.95）%。

3 討論

由于耐熱菌的最適生長(zhǎng)溫度較高，致使其代謝酶系通常也具有較高的熱穩(wěn)定性，因此從耐熱微生物尋找耐熱酶很有意義。本研究首次克隆來(lái)自耐熱菌B. paralicheniformis的左聚糖蔗糖酶基因，重組左聚糖蔗糖酶在50%底物濃度下的最適聚合溫度達(dá)40 ℃，雖然與嗜熱芽孢桿菌（Bacillus sp. TH4-2）（Ammar et al.，2002）和地衣芽孢桿菌RN-01（Nakapong et al.，2013）的50 ℃有差距，但高于目前多數(shù)已報(bào)道其他菌種的左聚糖蔗糖酶。例如，來(lái)源于枯草芽孢桿菌（B. subtilis NRC 33a）的左聚糖蔗糖酶在30 ℃時(shí)果糖轉(zhuǎn)化為左聚糖的效果最佳（Abdel-Fattah et al.，2005）;來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單細(xì)菌（Zymomonas mobilis）的左聚糖蔗糖酶在4 ℃下反應(yīng)時(shí)左聚糖產(chǎn)量最高，而在40 ℃下反應(yīng)時(shí)左聚糖產(chǎn)量明顯降低，低聚果糖的含量卻很高（Santos-Moriano et al.，2015）。值得注意的是，菌株LN-05與地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列雖然高度相似，但在高底物濃度下兩者的最適聚合反應(yīng)溫度相差10 ℃，且本研究中的重組左聚糖蔗糖酶最適聚合pH為5.0，而后者為6.0;Mn2+對(duì)后者的聚合反應(yīng)有促進(jìn)作用，但對(duì)本研究中的重組左聚糖蔗糖酶表現(xiàn)為抑制作用。氨基酸序列分析結(jié)果表明，本研究的B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶與地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶僅存在19個(gè)氨基酸殘基的差異，但導(dǎo)致明顯的酶學(xué)性質(zhì)變化，說(shuō)明這些差異氨基酸殘基中可能包含顯著影響聚合反應(yīng)性能及熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基，有待進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)加以分析，并借此對(duì)左聚糖蔗糖酶進(jìn)行分子改造，使其酶學(xué)性能進(jìn)一步提高。

此外，許多研究表明高底物濃度不利于左聚糖合成。例如，來(lái)源于丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola）的左聚糖蔗糖酶在較高底物濃度條件下水解反應(yīng)優(yōu)先左聚糖的形成，蔗糖濃度超過(guò)10%時(shí)，左聚糖產(chǎn)量開(kāi)始下降（Hettwer et al.，1995）;運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Z. mobilis B-14023）來(lái)源的左聚糖蔗糖酶在28 ℃、30%蔗糖濃度條件下左聚糖產(chǎn)量最高，當(dāng)蔗糖濃度高于30%時(shí)，隨著碳源濃度的增加，左聚糖的合成逐漸減少（Silbir et al.，2014）。本研究的重組左聚糖蔗糖酶在40 ℃、底物濃度50%的條件下合成左聚糖的蔗糖轉(zhuǎn)化率仍為（36.76±1.84）%，說(shuō)明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性和較強(qiáng)的底物濃度耐受性，即具有較高的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。但以產(chǎn)量為基準(zhǔn)的最適反應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)化率并不是最高，說(shuō)明酶的性能仍有提升空間，今后在酶分子改造和高底物下酶促反應(yīng)機(jī)制方面還值得深入研究。

4 結(jié)論

B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的熱穩(wěn)定性較好，左聚糖產(chǎn)量高，具有轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)高附加值左聚糖的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）

收稿日期：2020-04-07

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017GXNSFAA198128）;南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20141015）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，楊輝（1972-），博士，高級(jí)工程師，主要從事食品發(fā)酵和酶工程方面研究工作，E-mail：huiy422@gxu.edu.cn。叢豪（1997-），研究方向?yàn)榘l(fā)酵與酶工程應(yīng)用，E-mail：www.hao97.cn@qq.com