東方山羊豆種質(zhì)資源ISSR分析

羅天瓊　王小利　張瑜　莫本田　張明均

摘要：【目的】分析東方山羊豆種質(zhì)資源遺傳多樣性，為其種質(zhì)資源鑒定評價、新品種選育及開發(fā)利用提供理論參考?！痉椒ā恳?份引進(jìn)東方山羊豆種質(zhì)及其29份雜交后代為材料，利用ISSR引物對其進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，并以PopGene 32計算其遺傳參數(shù)，采用NTsys-pc 2.1計算遺傳相似系數(shù)，運(yùn)用SHAN模型中的非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）繪制聚類樹狀圖?！窘Y(jié)果】從24條ISSR引物中篩選出8條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性良好且易擴(kuò)增的引物，利用其從33份東方山羊豆種質(zhì)材料中共擴(kuò)增出79條條帶，其中65條具有多態(tài)性，多態(tài)百分率為82.15%;觀察等位基因數(shù)（Na）為1.6667～2.0000，平均為1.8215，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.2212～1.5740，平均為1.4242;Nei基因多樣性指數(shù)（H）為0.1521～0.3322，平均為0.2509，Shannon多態(tài)信息指數(shù)（I）為0.2473～0.4976，平均為0.3813。這些種質(zhì)材料遺傳相似系數(shù)為0.5696～0.9241，平均為0.7623，在0.7140處可劃分為三大類群（Ⅰ～Ⅲ），分別包含25、3和5份種質(zhì)材料，不同地理來源種質(zhì)相互混雜分布?！窘Y(jié)論】東方山羊豆遺傳多樣性較豐富，其中第Ⅱ類群和第Ⅲ類群遺傳多樣性較第Ⅰ類群更豐富，具有優(yōu)良親本基因源選擇的潛力，可作為東方山羊豆不同親本選配和雜種優(yōu)勢加以利用。

關(guān)鍵詞： 東方山羊豆;種質(zhì)資源;ISSR;聚類分析;遺傳多樣性

中圖分類號： S541.9 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2636-08

ISSR analysis of Galega orientalis germplasms resources

LUO Tian-qiong1， WANG Xiao-li1*， ZHANG Yu1， MO Ben-tian2， ZHANG Ming-jun3

（1Institute of Pratacultural， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang ?550006， China; 2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang ?550005， China;

3Guizhou Grassland Technology Test and Extension Station， Guiyang ?550006， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Galega orientalis germplasm resources was analyzed ?to provide theoretical reference for the identification and evaluation of G. orientalis germplasm resources，breeding of new varieties，development and utilization. 【Method】Four imported G. orientalis germplasms and 29 hybrid progenies were used as ma-terial for polymorphic amplification using ISSR primers. Based on the amplification results，The genetic parameters were calculated by PopGene 32. The genetic similarity coefficient analysis was performed by NTSYS 2.1，and the unweighted paired arithmetic mean（UPGMA） in SHAN model was used to construct the cluster tree. 【Result】Eight primers with clear polymorphic bands，good polymorphism and esay amplification were selected from 24 ISSR primers. A total of 79 bands were amplified from 33 G. orientalis germplasm resources by ISSR primers，among which 65 bands were polymorphic，the polymorphism ?rate ?was 82.15%. The observe number of alleles（Na） were ranged from 1.6667 to 2.0000，with average of 1.8215， the effective number of alleles（Ne） were 1.2212 to 1.5740，with an average of 1.4242. The Neis genetic diversity index（H） was ranged from 0.1521 to 0.3322，with an average of 0.2509. ?Shannon polymorphic information index （I） was ranged from 0.2473 to 0.4976，with an average of 0.3813. The genetic similarity coefficient of germplasm materials were 0.5696-0.9241，and the average was 0.7623. At genetic similarity coefficient of 0.714， the germplasm materials could be divided into three groups（Ⅰ-Ⅲ） with 25， 3 and 5 germplasm resources respectively， the different geographical source germplasm was mixed distribution. 【Conclusion】G. orientalis has rich genetic diversity， ?the class Ⅱand class Ⅲ germplasms of genetic diversity were more abundant than classⅠ，they have the potential of excellent parental gene source selection and can be used in different parental selection and heterosis utilization of G. orientalis.

2 結(jié)果與分析

2. 1 東方山羊豆種質(zhì)材料的ISSR多態(tài)性分析結(jié)果

33份東方山羊豆種質(zhì)材料基因組DNA的檢測結(jié)果見圖1。用24條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)807、834、835、836、868、856、ISSR22和ISSR26共8條ISSR引物的擴(kuò)增條帶清晰，條帶數(shù)較多，多態(tài)性良好，且易于擴(kuò)增，可用于33份東方山羊豆種質(zhì)材料的多態(tài)性擴(kuò)增，其中引物834的擴(kuò)增效果最好（圖2）。

利用篩選出的8條引物對33份東方山羊豆種質(zhì)材料共擴(kuò)增出79條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶65條，多態(tài)百分率為82.15%，平均每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為9.875條，平均每條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為8.125條（表3）。利用PopGene 32計算33份東方山羊豆種質(zhì)材料的遺傳參數(shù)，結(jié)果顯示，33份東方山羊豆種質(zhì)材料的Na為1.6667～2.0000，平均為1.8215，Ne為1.2212～1.5740，平均為1.4242;H為0.1521～0.3322，平均為0.2509，I為0.2473～0.4976，平均為0.3813（表3）。

2. 2 東方山羊豆種質(zhì)親緣關(guān)系分析結(jié)果

基于ISSR多態(tài)性分析結(jié)果，利用NTsys-pc 2.1計算獲得遺傳相似系數(shù)（表4）。遺傳相似系數(shù)越大，遺傳差異越小，表明親緣關(guān)系越近，遺傳多樣性越低;反之亦然。33份東方山羊豆種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)為0.5696～0.9241，平均為0.7623，其中，遺傳相似系數(shù)主要分布在0.6600～0.8590，說明33份東方山羊豆種質(zhì)材料間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近程度不同，遺傳多樣性豐富。GY04號白花（編號4）與GY05號白花（編號5）遺傳相似系數(shù)為0.9241，表明二者間遺傳距離最近;GY14號白花（編號13）與GYS18（編號33）的遺傳相似系數(shù)為0.5696，表明二者間遺傳距離最遠(yuǎn)，變異最大。

2. 3 東方山羊豆種質(zhì)的聚類分析結(jié)果

通過UPGMA法對33份供試材料的ISSR多態(tài)性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。33份東方山羊豆種質(zhì)資源在遺傳相似系數(shù)0.7140處可分為三大類群（Ⅰ～Ⅲ）。第Ⅰ類群包括25份種質(zhì)，其在遺傳相似系數(shù)0.7260處又可分為2個亞群Ⅰ-1和Ⅰ-2：Ⅰ-1亞類包括23份種質(zhì)，其中GY07號白花（編號7）、ZNK18（編號26）、GYN18（編號29）和GYP18（編號30）與其他19份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)介于0.7380～0.7500，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳多樣性較豐富;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在這19份種質(zhì)中，GY04號白花（編號4）與GY05號白花（編號5）種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近，遺傳差異最小，其余17份種質(zhì)中位于同一小分支種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性較低，如ZNH18（編號23）與GYI18（編號24）二者間、ZNE18（編號22）、ZN小葉（編號20）和GY大葉（編號19）三者間等。Ⅰ-2亞群包括GY08號白花（編號8）和GY17號白花（編號15）2份種質(zhì)，二者的遺傳相似系數(shù)為0.7342，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在一定的遺傳差異。第Ⅱ類群包括GY10號白花（編號10）、GY16號白花（編號14）和GYD18白花（編號16）3份種質(zhì)。第Ⅲ類群包括GYJ18（編號25）、GYM18（編號28）、GYQ18（編號31）、GYS18（編號33）和GYR18（編號32）等5份種質(zhì)，其中GYR18與另外4份遺傳相似系數(shù)介于0.7140～0.7260，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大，遺傳多樣性較豐富。綜上所述，不同地理來源種質(zhì)相互混雜分布，種質(zhì)資源間遺傳分布與地理來源間無明顯相關(guān)性，第Ⅱ類群和第Ⅲ類群東方山羊豆種質(zhì)材料間遺傳多樣性較第Ⅰ類群豐富。

3 討論

遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化的結(jié)果，也是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，其最直接的表現(xiàn)形式是遺傳變異。東方山羊豆是一種優(yōu)良豆科牧草，具有產(chǎn)草量高、利用年限長、促進(jìn)奶牛產(chǎn)奶、家畜采食不得膨脹病等特點(diǎn)，可部分替代紫花苜蓿，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值（沈禹穎等，2003）。當(dāng)前，東方山羊豆商業(yè)用種極少，主要栽培品種是前蘇聯(lián)和東歐國家培育的Gale，但其難以適應(yīng)我國不同生態(tài)區(qū)環(huán)境，無法大面積推廣種植。因此，選育適宜我國不同生態(tài)地區(qū)種植的新品種是推廣利用東方山羊豆的重要保證，而對東方山羊豆種質(zhì)資源遺傳多樣性評價是優(yōu)良新品種親本選擇的重要環(huán)節(jié)，也是挖掘創(chuàng)制新材料、培育新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究采用8條ISSR引物對33份東方山羊豆種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增79條帶，其中多態(tài)性條帶65條，多態(tài)百分率為82.15%，遺傳相似系數(shù)為0.5696～0.9241?？梢姡m然33份東方山羊豆種質(zhì)中有29份均為其余4份材料的雜交后代，但其遺傳多樣性仍較豐富;通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.7140處可分為三大類群，不同地理來源種質(zhì)相互混雜分布，表明種質(zhì)資源間遺傳分布與地理來源間無明顯相關(guān)性。余國輝等（2014）用9對ISSR引物對33份東方山羊豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出110條帶，其中多態(tài)性條帶107條，多態(tài)性比率為96.7%，遺傳相似系數(shù)為0.216～0.812，表明其遺傳多樣性較本研究供試材料更豐富;通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些東方山羊豆種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.42處分為三大類，不同地理來源種質(zhì)相互混雜分布。雖然本研究與Osterman等（2011）、余國輝等（2014）的供試東方山羊豆種質(zhì)資源來源于不同地理區(qū)域，但研究結(jié)果均表明東方山羊豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳分布與地理位置分布無明顯相關(guān)性。可見，東方山羊豆種質(zhì)資源遺傳背景廣泛，具有優(yōu)良親本基因源選擇的潛力，其原因可能是東方山羊豆為異花授粉植物，受自然環(huán)境選擇、基因突變、相互雜交等因素影響較大，導(dǎo)致其豐富的遺傳多樣性（Osterman et al.，2011;尹淑英等，2016）。

此外，本研究分析三大類群的形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一類群材料的葉形、葉長、葉寬、分枝數(shù)、花色、株高等形態(tài)學(xué)性狀的多樣性指數(shù)較豐富，如GYR18植株最高，GYI18分枝數(shù)最多，與王俊娥等（2008）的結(jié)論一致。因此，今后可進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記按照不同育種目標(biāo)需求選擇親本選配材料和雜種優(yōu)勢利用材料，為東方山羊豆種質(zhì)資源鑒定評價、新品種選育提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

東方山羊豆遺傳多樣性較豐富，其中第Ⅱ類群和第Ⅲ類群遺傳多樣性較第Ⅰ類群更豐富，具有優(yōu)良親本基因源選擇的潛力，可作為東方山羊豆不同親本選配和雜種優(yōu)勢加以利用。

參考文獻(xiàn)：

董志國. 2008. 新引1號東方山羊豆青貯試驗(yàn)[J]. 中國畜牧雜志，（4）：73-75. [Dong Z G. 2008. Experiment on silage of Galega orientalis Lam cv. Xinyin No.1[J]. Chinese Journal of Animal Science，（4）：73-75.]

郝偉偉，師帥，褐麗芳，沙偉. 2008. PEG脅迫下東方山羊豆抗旱生理特性的研究[J]. 齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報，24（2）：13-16. [Hao W W，Shi S，He L F，Sha W. 2008. There search of Galega orientaliss drought physiological characteristics in the stress of PEG[J]. Journal of Qiqihar University，24（2）：13-16.]

何世煒，常生華，武得禮. 2003. 飼用山羊豆引種研究初報[J]. 草業(yè)科學(xué)，20（11）：28-29. [He S W，Chang S H，Wu D L. 2003. Preliminary introduction study on Galega orien-talis Lam[J]. Pratacultural Science，20（11）：28-29.]

李杉杉，毛培春，郭靜雅，郭強(qiáng)，田小霞，孟林. 2016. 20個紫花苜蓿品種的ISSR遺傳多樣性分析[J]. 草原與草坪，36（4）：1-5. [Li S S，Mao P C，Guo J Y，Guo Q，Tian X X，Meng L. 2016. ISSR genetic diversity analysis of 20 alfalfa cultivar[J]. Grassland and Lawn，36（4）：1-5.]

劉法濤，楊志忠，張清斌，賈納堤. 2002. 優(yōu)良豆科牧草──東方山羊豆[J]. 草食家畜，（2）：42. [Liu F T，Yang Z Z，Zhang Q B，Jia N D. 2002. Fine leguminous forage─Galega orientalis[J]. Herbivore，（2）：42.]

劉莉，鄧春婷，包滿珠. 2008. 野牛草實(shí)生群體多樣性的表型及ISSR分析[J]. 草業(yè)科學(xué)，25（1）：100-105. [Liu L，Deng C T，Bao M Z. 2008. Analysis of genetic diversity within the population of buffalo grass by morphological traits and ISSR markers[J]. Pratacultural Science，25（1）：100-105.]

劉偉，張新全，李芳，馬嘯，范彥. 2007. 西南區(qū)野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR標(biāo)記與地理來源分析[J]. 草業(yè)學(xué)報，16（3）：55-61. [Liu W，Zhang X Q，Li F，Ma X，F(xiàn)an Y. 2007. Genetic diversity of Bermuda grass accessions in southwest China by ISSR molecular markers and geographical provenance[J]. Acta Prataculturae Sinica，16（3）：55-61.]

羅海燕，陳業(yè)淵. 2008. ISSR標(biāo)記的研究與應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)通報，14（19）：45-47. [Luo H Y，Chen Y Y. 2008. Research and application of ISSR[J]. Anhui Agricultural Bulletin，14（19）：45-47.]

沙偉，侯云杰，羅新義. 2008. 鹽脅迫對東方山羊豆生理特性的影響[J]. 北方園藝，（4）：29-31. [Sha W，Hou Y J，Luo X Y. 2008. Effects of salt stress oil physiological process of Galega orientalis L.[J]. Northern Horticulture，（4）：29-31.]

沙偉，師帥，羅新義，榮姝. 2007. 低溫脅迫對東方山羊豆幼苗生理特性的影響[J]. 北方園藝，（11）：63-64. [Sha W，Shi S，Luo X Y，Rong S. 2007. Effects of low temperature stress on physiological process of Galega L.[J]. Northern Horticulture，（11）：63-64.]

沈禹穎，張自和，謝田玲. 2003. 優(yōu)良豆科牧草東方山羊豆的研究與利用[J]. 草業(yè)學(xué)報，12（6）：105-109. [Shen Y Y，Zhang Z H，Xie T L. 2003. Research progress on goats rue[J]. Acta Prataculturae Sinica，12（6）：105-109.]

王俊娥，王贊，王運(yùn)琦，高洪文，Chapurin Vladimir F. 2008. 山羊豆種質(zhì)資源形態(tài)多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，9（2）：201-205. [Wang J E，Wang Z，Wang Y Q，Gao H W，Chapurin V F. 2008. Morphological diversity analysis of Galega officinalis L.[J]. Journal of Plant Genetic Resources，9（2）：201-205.]

徐榮，何麗蓮，王先宏，陳疏影，楊清輝，張漢堯，李富生. 2017. 斑茅野生種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 分子植物育種，15（7）：2874-2880. [Xu R，He L L，Wang X H，Chen S Y，Yang Q H，Zhang H Y，Li F S. 2017. Genetic diversity of Erianthus arundinaceus by ISSR mar-kers[J]. Molecular Plant Breeding，15（7）：2874-2880.]

尹淑英，Chapurin Vladimir F，Dzyubenko Nickolay I，高洪文，王贊. 2016. 37份山羊豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性SSR分析[J]. 中國草地學(xué)報，38（6）：29-33. [Yin S Y，Chapurin V F，Dzyubenko N I，Gao H W，Wang ?Z. 2016. Assessment of genetic diversity of 37 Galega of Ficinalis Lam. germplasms based on SSR markers[J]. Chiese Journal of Grassland，38（6）：29-33.]

余國輝，王贊，王俊娥，高洪文，Nikolay Dzyubenko，Vladimir Chapurin，呼天明. 2014. 東方山羊豆種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR分析[J]. 中國草地學(xué)報，36（3）：22-27. [Yu G H，Wang Z，Wang J E，Gao H W，Nikolay D，Vladimir C，Hu T M. 2014. Assessment of genetic diversity in Galega orientalis Lam. germplasms based on ISSR markers[J]. Chinese Journal of Grassland，36（3）：22-27.]

曾兵，張新全，范彥，蘭英，馬嘯，彭燕，劉偉. 2006. 鴨茅種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR研究[J]. 遺傳，28（9）：1093-1100. [Zeng B，Zhang X Q，F(xiàn)an Y，Lan Y，Ma X，Peng Y，Liu W. 2006. Genetic diversity of dactylis glomerata germplasm resources detected by inter-simple sequence repeats（ISSR） molecular markers[J]. Hereditas，28（9）：1093-1100.]

張利. 2004. 仲彬草屬植物的細(xì)胞學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 成都：四川大學(xué). [Zhang L. 2004. Study on cytology and molecular systematic in Kengyjlia[D]. Chengdu：Sichuan University.]

張清斌，李柱，朱忠艷. 2006. 新引1號東方山羊豆和紫花苜蓿飼喂荷斯坦奶牛試驗(yàn)研究初報[J]. 草食家畜，（S）：15-17. [Zhang Q B，Li Z，Zhu Z Y. 2006. A preliminary study on feeding Xinyin cv No.1 Galega orientalis Lam and alfalfa to holstein cows[J]. Herbivore，（S）：15-17.]

朱巖芳，祝水金，李永平，馬文廣，鄭昀曄，胡晉. 2010. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J]. 種子，29（2）：55-59. [Zhu Y F，Zhu S J，Li Y P，Ma W G，Zheng Y Y，Hu J. 2010. Application of ISSR molecular marker technology in the study of plant germplasm resources[J]. Seed，29（2）：55-59.]

Baimiev A K，Gubaidullin I I，Chemeris A V. 2005. Structures of sugar-binding peptides of Galega orientalis and Gofficinalis lectins determine the choice of partner in rhizo-bium legume symbiosis[J]. Molecular Biology，39（1）：90-97.

Fairey N A，Coulaman B E，F(xiàn)airey D T，Kunelius T，Mckenzie D B，Michaud R，Thomas W G，Lefkovitch L P. 2000. Cross Canada comparison of the productivity of fodder galega（Galega orientalis L.） with traditional her-bage legumes[J]. Canadian Journal of Plant Science，80（4）：793-800.

Kaijalainen S，Schroda M，Lindstrom K. 2002. Cloning of nodule-specific cDNAs of Galega orientalis[J]. Physiologia Plantarum，114（2）：588-593.

Kaksonen A H，Jussila M M，Lindstrom K，Suominen L. 2006. Rhizosphere effect of Galega orientalis in oil-contaminated soil[J]. Soil Biology and Biochemistry，38（4）：817-827.

Osterman J，Chizhevskaja E P，Andronov E E，Osterman J，Chizhevskaja E P，Andronov E E，F(xiàn)ewer D P，Terefework Z，Roumiantseva M L，Onichtchouk O P，Dresler-Nurmi A，Simarov B V，Dzyubenko N I，Lindstrom K. 2011. Galega orientalis is more diverse than Galega officinalis in Caucasus-whole-genome AFLP analysis and phylogenetics of symbiosis related genes[J]. Molecular Ecology，20（22）：4808-4821.

Peakall R，Smouse P E. 2006. Genalex6：Genetic analysis in Excel-Population genetic software for teaching and research[J]. Molecular Ecology Notes，（6）：288-295.

（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-02-14

基金項目：中國南方草地牧草調(diào)查項目（2017FY100602）;國家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-34）;貴州省科技計劃項目（黔科合支撐〔2016〕2624-2號）

作者簡介：*為通訊作者，王小利（1977-），博士，研究員，主要從事分子育種研究工作，E-mail：wangxiaolizhenyuan@126.com。羅天瓊（1969-），研究員，主要從事牧草種質(zhì)資源與育種研究工作，E-mail：ltq19691102@163.com