竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)與組培快繁研究

夏春英　謝小敏　劉江楓　鄭誠(chéng)樂(lè)

摘要：【目的】篩選出竹葉蘭各生長(zhǎng)階段適宜的培養(yǎng)基配方，建立竹葉蘭組培快繁體系?！痉椒ā恳灾袢~蘭種子為材料，采用1/2MS固體培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)比較不同種類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物的濃度配比對(duì)竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)、芽增殖生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響。【結(jié)果】（1）竹葉蘭種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+活性炭1g·L-1+椰子乳100mL·L-1+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+花寶1號(hào)0.5g·L-1，萌發(fā)率達(dá)83.79%;（2）芽增殖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA1mg·L-1+6-BA3mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+100g·L-1土豆泥，增殖率1.36;（3）芽生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-1+NAA（0.2-0.5）mg·L-1+100g·L-1香蕉泥;（4）煉苗移栽的最適培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖：泥炭土=1：1，成活率高達(dá)98%，移栽效果良好?！窘Y(jié)論】適宜的椰子乳有利于竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)，通過(guò)正交試驗(yàn)所建立的竹葉蘭組培快繁體系，可為竹葉蘭野生種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供保障。

關(guān)鍵詞：竹葉蘭;無(wú)菌萌發(fā);煉苗移栽;正交設(shè)計(jì);組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1215-07

0引言

【研究意義】竹葉蘭[Arundina graminifolia（D.Don）Hochr.]隸屬蘭科（Orchidaceae）竹葉蘭屬（Arundina），多年生草本植物，在國(guó)內(nèi)主要分布于華南和西南地區(qū)，國(guó)外主要分布于南亞及東南亞國(guó)家，如尼泊爾、印度、緬甸、越南等[1]。竹葉蘭是西雙版納地區(qū)傣族人民常用的植物藥，也是西雙版納傣族自治州民族醫(yī)藥研究所院內(nèi)制劑的處方藥材[2-3];其花朵美麗清雅，花色清新，且花期長(zhǎng)，可以盆栽，也可以用于庭院綠化或園林綠化中，具有很高的觀賞價(jià)值[4-5]。近年來(lái)，因自然資源的掠奪性采挖和竹葉蘭自身種子繁殖的困難性，野外種質(zhì)資源大大減少[5-6]，已被列為國(guó)家II級(jí)保護(hù)植物[7]，因此開(kāi)展竹葉蘭人工組織快繁研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，國(guó)際上已有關(guān)于竹葉蘭原生境分布、野生資源調(diào)查、傳粉機(jī)制等方面的一些研究報(bào)道[8]，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究報(bào)道多集中在竹葉蘭藥用成分分析[9-10]方面。關(guān)于竹葉蘭快繁技術(shù)，相關(guān)學(xué)者開(kāi)展過(guò)竹葉蘭引種栽培和無(wú)菌播種的研究[11-13]。已有研究表明，椰子乳有利于種子萌發(fā)，且添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可以促進(jìn)種子萌發(fā)[12-14]。在瓶苗煉苗移栽階段，黃素榮等[6，15]研究認(rèn)為水苔是竹葉蘭試管苗的最優(yōu)栽培基質(zhì)。金建鵬等[16]分析了不同外植體、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基類型及天然添加物對(duì)原球莖誘導(dǎo)、原球莖增殖的影響，篩選出竹葉蘭原球莖快速誘導(dǎo)與增殖的培養(yǎng)基配方。以種子為外植體材料開(kāi)展的植物組織培養(yǎng)是竹葉蘭快繁技術(shù)研究的內(nèi)容之一。對(duì)蘭科植物而言，種子的數(shù)量龐大，在快速繁殖研究過(guò)程中具有以量取勝的優(yōu)勢(shì)。因此，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，可以獲得大量的竹葉蘭組培苗，如果將其回歸野外，就能擴(kuò)大野生種質(zhì)資源，再通過(guò)合理開(kāi)發(fā)利用，即可達(dá)到保育目的，又能不降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)關(guān)于竹葉蘭的組培快繁技術(shù)，尚少見(jiàn)以正交設(shè)計(jì)方式開(kāi)展不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及添加物的優(yōu)化組培研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)方法探索不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物等對(duì)竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)、芽增殖生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，以期建立優(yōu)良的竹葉蘭快繁體系，為竹葉蘭野生種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供保障。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2018年6月對(duì)福州市于山風(fēng)景區(qū)蘭花圃內(nèi)栽培的竹葉蘭進(jìn)行人工授粉，取授粉成功后90d未開(kāi)裂的果實(shí)（異花授粉果）無(wú)菌播種。芽的增殖與生根培養(yǎng)材料來(lái)白無(wú)菌播種80d的無(wú)根種胚苗。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子萌發(fā)培養(yǎng)基篩選 培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基成分為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8，121℃下高溫高壓滅菌20min;以授粉后3個(gè)月的種子進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，采用L9（34）正交試驗(yàn)研究不同質(zhì)量濃度的椰子乳、NAA、6-BA、花寶1號(hào)對(duì)種子萌發(fā)的影響，每種處理15瓶，重復(fù)3次。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度23±2℃，光照強(qiáng)度30～40μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間12h·d-1。

種子處理：選取授粉后3個(gè)月的竹葉蘭新鮮蒴果。洗衣粉中浸洗20min，再用清水沖洗2h，移至超凈工作臺(tái)，加入75%乙醇浸洗1min，無(wú)菌水沖洗5次（每次5min），2%次氯酸鈉溶液消毒20min，無(wú)菌水沖洗6次（每次5min）。用手術(shù)刀切除消毒清洗后用滅菌濾紙吸干水分的蒴果兩端，剖開(kāi)蒴果，取出種子，將其均勻撒播在已高溫高壓滅菌好的培養(yǎng)基表面。

無(wú)菌播種后定期觀察種子萌發(fā)情況，培養(yǎng)60d后，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各組種子萌發(fā)率，每瓶隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，以種胚膨大和種皮破裂作為種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。

種子萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)）×100

（1）

1.2.2芽的增殖與生根 以無(wú)菌播種45d后尚未生根的種胚苗為材料，采用L9（34）正交試驗(yàn)分析IBA、6-BA、NAA、添加物（香蕉泥和土豆泥）對(duì)竹葉蘭種胚無(wú)菌苗芽增殖與生根的影響，培養(yǎng)條件同

1.2.1。每瓶接種5株，3次重復(fù)，每次重復(fù)10瓶。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)增殖數(shù)、生根數(shù)，測(cè)量株高和根長(zhǎng)，篩選出適合竹葉蘭種胚無(wú)菌苗芽增殖和生根的最佳培養(yǎng)基。

增殖系數(shù)（%）=（增殖后芽數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

（2）

生根率（%）=（生根根數(shù)/生根不定芽數(shù)）×100

（3）

1.2.3煉苗移栽 將生根瓶苗（3～5片葉）移至室外陰涼處，閉瓶培養(yǎng)5d，擰松平蓋透氣培養(yǎng)5d，使其適應(yīng)外界環(huán)境。從組培瓶中取出生根苗，用清水洗凈培養(yǎng)基，用0.1%的多菌靈浸泡5～10min后撈出，移植到不同基質(zhì)中，使用噴霧器將基質(zhì)澆透，用水流使基質(zhì)與苗緊密接觸，之后常規(guī)水肥管理。移栽60d后測(cè)定成活率和株高、葉數(shù)、莖粗等指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)處理

所測(cè)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)種子萌發(fā)的影響

竹葉蘭無(wú)菌播種10d后，種子由淡黃色轉(zhuǎn)綠，種胚變綠，但未完全突破種皮（圖1-A）。播種45d后，種胚完全突破種皮，形成帶芽原球莖（圖1-B）。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，椰子乳對(duì)種子萌發(fā)的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.04），NAA，6-BA和花寶1號(hào)對(duì)竹葉蘭種子萌發(fā)的影響不顯著（P>0.05）。對(duì)培養(yǎng)基各組分濃度進(jìn)一步分析比較。從表1中各因素的R值比較可知培養(yǎng)基各組分對(duì)竹葉蘭種子萌發(fā)影響的主次關(guān)系為椰子乳>NAA>6-BA>花寶1號(hào)。由K值大小比較可得適合竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)的培養(yǎng)基組成為處理6：1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+活性炭1g·L-1+椰子乳100mL·L-1+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+花寶1號(hào)0.5g·L-1。

2.2不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)芽增殖的影響

正交試驗(yàn)各因素方差分析結(jié)果顯示，各培養(yǎng)基組分對(duì)竹葉蘭無(wú)菌播種80d的種胚苗芽增殖的影響均不顯著（P>0.05），根據(jù)各組分的R值（表2）大小可知，4種組分對(duì)芽增殖系數(shù)的影響主次關(guān)系為IBA>添加物>6-BA>NAA;K值比較可得竹葉蘭芽增殖培養(yǎng)的最優(yōu)組合為處理9：1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA1mg·L-1+6-BA3mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+添加物3（100g·L-1土豆泥），增殖系數(shù)1.36。

2.3不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加物對(duì)芽生根的影響

正交試驗(yàn)各因素方差分析結(jié)果顯示，IBA和NAA對(duì)竹葉蘭無(wú)菌播種80d的種胚苗芽生根的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01），6-BA和添加物對(duì)芽生根的影響不顯著（P>0.05）。

根據(jù)各組分的R值（表3）大小可知，4種組分對(duì)芽生根數(shù)的影響主次關(guān)系為IBA>添加物>6-BA>NAA，對(duì)根長(zhǎng)的影響主次關(guān)系為IBA>6-BA>NAA>添加物;K值比較可得竹葉蘭芽生根數(shù)最多的培養(yǎng)基組合為：1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+添加物1（100g·L-1香蕉泥），根長(zhǎng)最長(zhǎng)的培養(yǎng)基組合為：1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-+NAA0.5mg·L-+添加物2（50g·L-1香蕉泥+50g·L-1土豆泥）。

綜合上述分析結(jié)果，本試驗(yàn)中竹葉蘭無(wú)菌種胚苗芽生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基以1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-1+NAA（0.2～0.5）mg·L-1+添加物1（100g·L-1香蕉泥）為宜。

2.4煉苗移栽

竹葉蘭組培苗移栽試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)煉苗后的竹葉蘭已生根瓶苗，移栽，幼苗葉片顏色變深、硬度增加。在60d后統(tǒng)計(jì)移栽成活數(shù)據(jù)和移栽苗生長(zhǎng)情況，由表4可知，7種不同基質(zhì)中的成活率以處理4（v珍珠石：v泥炭土=1：1）的最高，達(dá)98%，處理2、3和6次之，成活率分別為88%、86%和80%，處理1最低，僅34%。

此外，通過(guò)測(cè)量移栽苗的其他表型數(shù)據(jù)（表5）可知，不同基質(zhì)中移栽苗的生根數(shù)差異不顯著，均有5根以上;處理3在株高、中間葉寬和鮮重指標(biāo)上與其他處理存在顯著差異（P<0.05）;從葉片數(shù)和莖粗指標(biāo)來(lái)看，處理3、4和5均有較好的移栽效果。

3討論與結(jié)論

已有研究表明，適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或添加物是促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)及后期生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素[19]。目前，在竹葉蘭的研究中，組培快繁技術(shù)方面的研究已逐漸增多，其中，竹葉蘭以種子為外植體材料開(kāi)展的組培快繁技術(shù)基本環(huán)節(jié)主要包括誘導(dǎo)種子萌發(fā)、芽增殖生根與煉苗移栽等，而種子中遺傳物質(zhì)等的差異有可能導(dǎo)致在各個(gè)培養(yǎng)環(huán)節(jié)對(duì)外界條件要求各異[20]，只有通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，不斷嘗試新的試驗(yàn)方法，才能篩選出最適宜的培養(yǎng)基配方。

本研究中，以竹葉蘭種子為外植體材料，在前人研究基礎(chǔ)上結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探索不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、添加物等對(duì)誘導(dǎo)種子無(wú)菌萌發(fā)、促進(jìn)芽增殖生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，獲得的種子最適萌發(fā)培養(yǎng)基配方為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+活性炭1g·L-1+椰子乳100mL·L-1+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+花寶1號(hào)0.5g·L-1，萌發(fā)率達(dá)83.79%。與陳之林等[12]的研究相比，本試驗(yàn)增加了種子萌發(fā)培養(yǎng)基中的外源激素成分，方差分析結(jié)果顯示，椰子乳是影響竹葉蘭種子萌發(fā)的主要因子，外源激素NAA和6-BA對(duì)種子萌發(fā)和原球莖膨大的影響效果較小，為非必需，且當(dāng)椰子乳為100mL·L-1時(shí)，萌發(fā)效果最好;與張文珠等[14]的研究相比，本試驗(yàn)中的椰子乳較之香蕉泥和酪蛋白等添加物可明顯提高種子萌發(fā)率，也驗(yàn)證了金建鵬等[16]的種子萌發(fā)研究結(jié)果。

本試驗(yàn)中，IBA、NAA、6-BA和添加物四個(gè)因素對(duì)竹葉蘭無(wú)菌種胚苗芽的增殖效果均不顯著，但I(xiàn)BA和NAA對(duì)竹葉蘭無(wú)菌種胚苗芽的生根具有極顯著影響。正交試驗(yàn)篩選出適宜竹葉蘭種胚苗芽增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA1mg·L-1+6-BA3mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+100g·L-1土豆泥，增殖率1.36;適宜芽生根的培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-1+NAA（0.2～0.5）mg·L-1+100g·L-1香蕉泥。這與其他學(xué)者[14]的一些研究結(jié)果有所不同，但外源激素對(duì)植物的作用機(jī)制本就不可一概而論，造成竹葉蘭與其他植物[18-19]間差異的原因還有待進(jìn)一步探索其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或添加物的適宜配比和濃度。

移栽成活率是組培能否走向工廠化生產(chǎn)的重要指標(biāo)。在以往的研究報(bào)道中，移栽環(huán)境處于非完全的白然狀態(tài)，竹葉蘭組培苗的移栽成活率為80%～85%[12.14]。本試驗(yàn)中，將生根瓶苗練苗適應(yīng)外界環(huán)境后，以7種移栽基質(zhì)為對(duì)比，僅作正常的水肥管理，其他條件處于白然狀態(tài)，分析煉苗后的竹葉蘭幼苗生長(zhǎng)和成活情況，試驗(yàn)結(jié)果表明，煉苗移栽的最適培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖：泥炭土=1：1，成活率高達(dá)98%，移栽效果良好。其中，水苔的移栽成活率明顯低于其他6種基質(zhì)，筆者考慮其可能是由于本試驗(yàn)使用的水苔質(zhì)量較差造成。

本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)方法探索了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、添加物等對(duì)竹葉蘭種子無(wú)菌萌發(fā)、芽增殖生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響。結(jié)果表明：種子萌發(fā)最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30.0g·L-1+活性炭1g·L-1+椰子乳100mL·L-1+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1+花寶1號(hào)0.5g·L-1，萌發(fā)率達(dá)83.79%;芽增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA1mg·L-1+6-BA3mg·L-1+NAA0.5mg-L-1+100g·L-1土豆泥，增殖系數(shù)1.36;芽生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為1/2MS+瓊脂7g·L-1+蔗糖30g·L-1+活性炭1g·L-1+IBA0.2mg·L-1+6-BA2mg·L-1+NAA（0.2～0.5）mg·L-1+100g·L-1香蕉泥;煉苗移栽最適培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖：泥炭土=1：1，煉苗移栽60d后成活率高達(dá)98%。

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（責(zé)任編輯：翁志輝）

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收稿日期：2020-04-18初稿;2020-08-06修改稿

作者簡(jiǎn)介：夏春英（1996-），女，碩上，研究方向：花卉與景現(xiàn)園藝（E-mail： 1144179784@qq.com）

*通信作者：鄭誠(chéng)樂(lè)（1963-），男，博士，教授，研究方向：花卉與景觀園藝、果樹(shù)栽培生理與生化（E-mail： zcl2003@126.com）

基金項(xiàng)目：福州市園林局科研項(xiàng)目（201404）