蛋白質(zhì)藥物糖基化工程化改造研究進(jìn)展

杜力,劉曉志,魏敬雙,高健

華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050015

與小分子藥物相比，重組治療蛋白藥物因靶向特異性高、副作用小而越來(lái)越受歡迎。重組胰島素是1982年禮來(lái)公司在大腸桿菌中生產(chǎn)的第一種FDA批準(zhǔn)的生物治療藥物，商標(biāo)名為Humulin?(Carter 2011)。Humulin?是一種非糖基化的蛋白質(zhì)，因此利用大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)。促紅細(xì)胞生成素是1985年美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Adminstration,FDA)批準(zhǔn)的第一種糖基化重組糖蛋白，由Amgen公司在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生，商品名為Epogen[1]?，F(xiàn)臨床使用的大部分重組治療蛋白藥物為糖基化蛋白，糖基化是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，其組成將影響蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、溶解性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，糖基化對(duì)糖蛋白生物學(xué)功能具有重要影響，應(yīng)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程加以控制，以使蛋白藥物達(dá)到最佳的治療效果[2]。由于生產(chǎn)宿主細(xì)胞種類和生理狀態(tài)不同，造成重組糖蛋白的糖基化模式具有明顯差異[3]。大部分重組糖蛋白上的非均質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)糖基化過(guò)程中產(chǎn)生的。近年來(lái),研究者對(duì)糖基化進(jìn)行了大量研究，以克服聚糖異質(zhì)性，并建立體內(nèi)和體外糖工程技術(shù)用于高效生產(chǎn)均一化的糖蛋白藥物[4]。定制糖基化技術(shù)不但是研究糖蛋白藥物治療中聚糖功能必不可少的工程手段，也代表了下一代新型蛋白藥物的發(fā)展方向。本文綜述了蛋白質(zhì)藥物的 N-糖基化改造和O-糖基化改造的最新進(jìn)展，以期為定制糖基化技術(shù)的相關(guān)研究提供參考。

1 蛋白質(zhì)藥物的 N-糖基化改造

蛋白質(zhì)糖基化是在新合成的蛋白質(zhì)上，一個(gè)多糖與天冬酰胺(N-糖基化)側(cè)鏈中的酰胺的連接。蛋白質(zhì)的N-糖基化開(kāi)始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)內(nèi)腔，在酶的催化作用下將寡糖前體轉(zhuǎn)移到多肽上的Asn-X-Ser/Thr(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)序列上。這種最初的聚糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)是由異聚低聚糖基轉(zhuǎn)移酶(oligosaccharyl transferase，OST)催化完成的[5]。低聚糖轉(zhuǎn)移后，兩個(gè)末端的葡萄糖殘基立即被α-葡萄糖苷酶I和II分解，產(chǎn)生的具有單葡萄糖的酰化聚糖結(jié)構(gòu)，再與ER膜結(jié)合凝集素鈣黏蛋白或可溶性鈣網(wǎng)蛋白反應(yīng)[6]。這些凝集素在一個(gè)依賴于聚糖的蛋白質(zhì)循環(huán)中支持蛋白質(zhì)的折疊。具有天然構(gòu)象的分泌性糖蛋白從鈣黏蛋白/鈣網(wǎng)蛋白循環(huán)中釋放，并從ER分泌到高爾基體[7]。在高爾基體中，成熟折疊的糖蛋白上的ER-低聚甘露聚糖經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的N-甘露聚糖加工，產(chǎn)生具有不同功能性質(zhì)的高度多樣性復(fù)合的N-甘露聚糖[8]。

1.1 蛋白藥物N-糖基化改造的基本策略

糖蛋白藥物的異質(zhì)性來(lái)源于糖基化位點(diǎn)及糖基化效率。糖基化效率的差異取決于制備系統(tǒng)和蛋白質(zhì)的固有特征[9]。幾乎所有真核細(xì)胞都具有蛋白N-糖基化功能，Asn-X-Ser/Thr序列的存在是必須的，但在不同物種間，糖基化位點(diǎn)上存在差異。因此，這種差異導(dǎo)致重組蛋白的異常糖基化。蛋白質(zhì)內(nèi)在因素，如氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及其他蛋白修飾的存在，如二硫鍵形成，都有助于提高N-糖基化效率[10]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含兩種OST復(fù)合物，它們的催化亞單位和輔助蛋白不同，這些OST復(fù)合物功能相似，但也對(duì)不同的糖蛋白底物存在偏好。基因構(gòu)建統(tǒng)一的OST復(fù)合物是克服N-糖基化位點(diǎn)占有率差異的一種途徑[11]。然而，在真核生物中，不同的OST催化亞單位及其附屬蛋白的特殊作用還沒(méi)有被完全闡述，使得基因構(gòu)建合成存在困難[12]。在利什曼原蟲(chóng)等原生動(dòng)物中，OST復(fù)合物由一個(gè)單亞單位組成，該亞單位可取代整個(gè)釀酒酵母復(fù)合物，并可用于克服蛋白質(zhì)的糖基化不足。甲基缺陷型畢赤酵母中過(guò)度表達(dá)單亞單位OST，使單克隆抗體的N-糖基化位點(diǎn)效率從75%增加到85%，甚至超過(guò)99%。

另一種降低異質(zhì)蛋白的基因技術(shù)，是突變N-糖基化蛋白序列，例如，將真核生物中Asn-X-Ser突變?yōu)锳sn-X-Thr能夠有效提高N-糖基化效率[13]。除了修改共識(shí)序列本身，相鄰的氨基酸也可以改變以提高N-糖基化的效率。這些基因技術(shù)的主要缺點(diǎn)是改變了治療性糖蛋白的主要氨基酸序列，這可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，并可能產(chǎn)生其他問(wèn)題。然而，新興N-糖基化位點(diǎn)技術(shù)已經(jīng)成功用于重組蛋白設(shè)計(jì)，這種方法最突出的例子是Darboetin Alfa方法。這種高糖基化重組促紅細(xì)胞生成素(erthropoietin,EPO)異構(gòu)體被設(shè)計(jì)成攜帶5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，另外增加的兩種N-聚糖，不但增加了蛋白質(zhì)半衰期，還提高了蛋白質(zhì)唾液酸總含量[14]。在另一項(xiàng)更優(yōu)秀的設(shè)計(jì)中，將一個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)引入抗HIV-1受體CD4的單克隆抗體的輕鏈中，大大提高了抗體對(duì)病毒的中和活性?？傊?，這些例子說(shuō)明，通過(guò)蛋白質(zhì)基因技術(shù)可以增加蛋白質(zhì)額外糖基化[15]。

通常重組糖蛋白的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生同一蛋白質(zhì)的不同聚糖的混合物。這意味著哺乳動(dòng)物細(xì)胞的N-糖元顯示了廣泛的N-聚糖成分，從低聚甘露糖到支鏈復(fù)合型N-聚糖。N-聚糖微不均一性源于加工的變化，這取決于許多細(xì)胞因素，包括加工酶的組織/細(xì)胞類型特異性表達(dá)、濃度和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)、核苷酸糖供體和糖蛋白的可用性、在高爾基體中的停留時(shí)間等。此外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性對(duì)特異N-聚糖位點(diǎn)加工有很大的影響。利用糖生物學(xué)方法控制糖基化酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響鼠組織或癌細(xì)胞糖蛋白上的N-聚糖結(jié)構(gòu)[16]。在小鼠組織中，巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移酶與相應(yīng)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)呈正相關(guān)。另一方面，對(duì)于復(fù)雜的N-聚糖形成或唾液酸化的影響不確定，這突出了這些修飾和生成步驟的復(fù)雜性。此外，研究者還建立數(shù)學(xué)模型來(lái)預(yù)測(cè)酶的表達(dá)、亞細(xì)胞定位、核苷酸糖水平和培養(yǎng)條件對(duì)聚糖加工的影響。雖然所描述的模型可能有助于預(yù)測(cè)重組單克隆抗體上相當(dāng)均勻的Fc-糖基化，但這些模型假設(shè)還必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證[17]。此外，目前數(shù)學(xué)模型的穩(wěn)健性正在重組糖蛋白的宿主細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試，包括測(cè)試重組糖蛋白異質(zhì)，糖基化模式包括N-聚糖的分支和唾液酸化[18]。

產(chǎn)生糖基化微小異質(zhì)性的因素包括同一低聚糖底物參與不同酶競(jìng)爭(zhēng)以及內(nèi)源性糖蛋白對(duì)高爾基體加工干擾和接觸時(shí)間的差異。人們普遍認(rèn)為高爾基體加工酶是按順序排列在高爾基體內(nèi)，但通常存在多個(gè)酶重疊分布的現(xiàn)象。這些酶可以修飾相同的聚糖中間體結(jié)構(gòu)，阻斷其他糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的作用。例如，通過(guò)向復(fù)合N-聚糖中添加N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶III抑制劑，可防止其他高爾基體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步修飾。這種底物競(jìng)爭(zhēng)和進(jìn)一步加工抑制是Glycart生物技術(shù)公司開(kāi)發(fā)的糖基化單克隆抗體的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)用于生產(chǎn)減少α-1,6-連接核心巖藻糖含量的糖基化工程單克隆抗體。由該平臺(tái)構(gòu)建的一種抗CD20的Obinutuzumab單克隆抗體最近被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病。復(fù)雜N-聚糖的底物相同，其常見(jiàn)的修飾為半乳糖基化和多分支化[19]。除了在同一生物中參與這些競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)外，還參與分解代謝過(guò)程。細(xì)胞外α-神經(jīng)氨酸酶或β-己糖胺酶可與末端糖殘基作用，并在分泌后將其從暴露的N-聚糖中去除，導(dǎo)致重組糖蛋白上的聚糖類別發(fā)生變化[20]。因此，基因失活或抑制競(jìng)爭(zhēng)性糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶是防止不想要的聚糖修飾和降低糖基化的有效策略[21]。在酵母或植物中成功地產(chǎn)生具有均勻糖基化的重組糖蛋白治療藥物，其N-聚糖加工機(jī)制比哺乳動(dòng)物細(xì)胞要簡(jiǎn)單得多。在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，研究表明“簡(jiǎn)化策略”在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也是可行的。在高爾基體內(nèi)缺乏UDP半乳糖的LEC8 CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體表現(xiàn)為均一N-聚糖[22]。

重組糖蛋白在高爾基體內(nèi)的停留時(shí)間與膜的接觸時(shí)間以及聚糖修飾酶是影響蛋白質(zhì)微異質(zhì)性的其他因素。蛋白質(zhì)在高爾基體的停留時(shí)間和通過(guò)高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)方面存在差異，導(dǎo)致對(duì)聚糖修飾的差異。停留時(shí)間分布和與糖基化酶的相互作用取決于高爾基體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)模式(囊泡運(yùn)輸/管狀連接、池成熟、快速分割或混合模型)、細(xì)胞類型和特有機(jī)體組織類型[23]。此外，最新研究表明，蛋白質(zhì)通過(guò)不同機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)也可能與不同的高爾基體酶相互作用。對(duì)于某些糖基化過(guò)程已經(jīng)證明其跳過(guò)了某些糖基化酶的修飾。盡管在這一領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展，但是還不能獲得對(duì)于不同重組糖蛋白的高爾基體動(dòng)力學(xué)以及對(duì)甘氨酸產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所以還不能合理地設(shè)計(jì)產(chǎn)生更均勻甘氨酸結(jié)構(gòu)的基因工程化轉(zhuǎn)運(yùn)和其他轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。換句話說(shuō)，對(duì)于許多基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，我們需要更好地了解細(xì)胞運(yùn)輸過(guò)程，以減少與糖基化勻質(zhì)相關(guān)的高爾基體停留時(shí)間或高爾基體內(nèi)運(yùn)輸。

對(duì)位點(diǎn)特異性修飾主要取決于蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)。某些蛋白質(zhì)構(gòu)象通過(guò)空間位阻完全阻止或限制加工酶進(jìn)入[24]。像Cetuximab單克隆抗體在重鏈可變區(qū)域加上一個(gè)額外的N-聚糖是在同一分子上進(jìn)行位點(diǎn)特異性的典范。雖然Cetuximab Fc上的N-聚糖的修飾程度較低，但可變區(qū)域的N-聚糖暴露程度較高。在不改變蛋白質(zhì)功能的情況下，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)內(nèi)在特征的策略是具有挑戰(zhàn)性的，但增加獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及強(qiáng)大的分子動(dòng)力學(xué)模擬將為位點(diǎn)特異性聚糖基因克隆提供新的可能性?；蛘?，針對(duì)松馳的或新穎的底物特異性的聚糖修飾酶的合理設(shè)計(jì)可以對(duì)一些位點(diǎn)進(jìn)行更有效的處理。

1.2 蛋白質(zhì)藥物表達(dá)系統(tǒng)的糖基化改造

目前，用于糖蛋白治療藥物的大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的N-聚糖化均不是人的糖基化，因此可能導(dǎo)致藥物的潛在副作用。這些非人源表位可能會(huì)引起不必要的免疫反應(yīng)，從而中和所使用的藥物，甚至引起超敏反應(yīng)。

1.2.1哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖基化改造 在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組糖蛋白攜帶非人源的唾液酸N-乙醇亞甲亞酸(Neu5Gc)。此外，由于CHO細(xì)胞缺乏相應(yīng)的α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，因此CHO細(xì)胞以α-2,3-鍵連接N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，而不是以α-2,6-鍵連接，而α-2,6-鍵主要存在于人類糖蛋白的N-聚糖上。已有研究已經(jīng)提出了許多不同的方法來(lái)消除Neu5Gc 糖基化，最直接的糖基化基因克隆技術(shù)策略是編碼CMP-Neu5Ac 羥化酶基因的敲除，這種酶可以將CMP-Neu5Ac 轉(zhuǎn)化為CMP-Neu5Gc。同樣，α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)化酶可以通過(guò)基因消除技術(shù)、異位表達(dá)來(lái)缺失α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)化酶，從而產(chǎn)生人的N-糖基化蛋白[25]。NS0和SP2/0小鼠骨髓瘤或幼鼠倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞產(chǎn)生具有半乳糖-1,3-半乳糖的糖蛋白，代表人類的抗基因表位。具有代表性的α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在人類中是不活躍的，但存在于大多數(shù)非人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中。BHK細(xì)胞產(chǎn)生的重組人凝血因子Ⅷ(rhFVIII)攜帶3%的α-Gal表位，但在人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)中產(chǎn)生的rhFVIII上未檢測(cè)到該表位。大量的α-Gal表位明顯存在于來(lái)自西妥昔單抗可變區(qū)的N-糖基化蛋白中，Cetuximab單抗在SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞中產(chǎn)生且在世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療不同類型的癌癥。在美國(guó)，一些西妥昔單抗治療的患者對(duì)該藥物的過(guò)敏反應(yīng)與α-Gal表位的存在有關(guān)。這個(gè)例子強(qiáng)調(diào)了糖克隆基因技術(shù)對(duì)于產(chǎn)生治療性更好的蛋白的重要性[25]。

HEK293細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的糖基化可能是高度異質(zhì)性的，包括具有不同的雙觸角和分支結(jié)構(gòu)的末端糖殘基，因此，不一定類似于血清中的N-糖基化蛋白。盡管已有研究報(bào)道人細(xì)胞缺乏N-聚糖加工步驟(例如，GnTI缺陷)，但德國(guó)Glyctope公司可以提供人糖基化基因技術(shù)產(chǎn)生的人細(xì)胞重組糖蛋白，在人類細(xì)胞中產(chǎn)生勻質(zhì)復(fù)雜的糖基化蛋白[26]。 比較CHO和HEK293細(xì)胞中表達(dá)的幾種不同蛋白質(zhì)表明，HEK293細(xì)胞產(chǎn)生的重組糖蛋白中，N-糖基化與唾液酸含量顯著降低。除了降低異質(zhì)性外，人細(xì)胞的糖基化基因技術(shù)的潛在目標(biāo)是消除核心巖藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶III，后者產(chǎn)生平分型的N-乙酰葡糖胺，從而阻止分支蛋白和唾液酸化酶的進(jìn)一步加工和過(guò)度表達(dá)[27-28]。

1.2.2酵母細(xì)胞的糖基化改造 酵母的高甘露糖基化N-聚糖結(jié)構(gòu)與人N-聚糖基化有顯著差異，可能引起影響藥物生物活性的免疫原性反應(yīng)。在巴斯德酵母的開(kāi)創(chuàng)性工作表明，通過(guò)消除有害的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和控制其他物種的甘露糖酶和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，可以在酵母中生成人源N-聚糖。GlycoFi公司成功對(duì)糖基化酶組合庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，設(shè)計(jì)了用于區(qū)分亞細(xì)胞定位和高效生產(chǎn)，以及用于生產(chǎn)特定N-聚糖的重組蛋白。最近，本團(tuán)隊(duì)采用了相似但更合理的設(shè)計(jì)方法來(lái)消除高甘露糖，并設(shè)計(jì)了巴斯德酵母、釀酒酵母、耶氏解脂酵母和漢遜酵母，來(lái)生產(chǎn)具有人源化N-聚糖基化的重組糖蛋白[29]。

1.2.3昆蟲(chóng)細(xì)胞的糖基化改造 昆蟲(chóng)細(xì)胞通常會(huì)產(chǎn)生短N(yùn)-聚糖，這是由于β-己糖胺酶的作用。此外，在一些昆蟲(chóng)細(xì)胞系中表達(dá)的重組糖蛋白上存在潛在的免疫原性核心α-1,3-巖藻糖殘基。為了克服這些缺點(diǎn)，研究者開(kāi)發(fā)了不同的方法，并開(kāi)發(fā)了糖工程昆蟲(chóng)細(xì)胞，在巖藻糖缺乏的情況下，產(chǎn)生半乳糖基化N-聚糖的單克隆抗體。

1.2.4植物細(xì)胞的糖基化改造 植物通常產(chǎn)生相當(dāng)簡(jiǎn)單的四分位復(fù)合N-聚糖，其上連有β-1,2-木糖和核心α-1,3-巖藻糖殘基，哺乳動(dòng)物的N-聚糖上未發(fā)現(xiàn)這些糖基化，為潛在的免疫原性殘基?；蚯贸殉晒Φ赜糜趶牟煌参锷a(chǎn)的重組治療糖蛋白藥物中去除β-1,2-木糖和核心α-1,3-巖藻糖。與通常CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組單克隆抗體相比，植物細(xì)胞的單克隆抗體的N-聚糖高度更加均勻，主要表現(xiàn)為GlcNAc2Man3GlcNAc2-聚糖，這是進(jìn)一步修飾如分支或半乳糖基化的最佳底物[30]。值得注意的是，基于煙草植物表達(dá)平臺(tái)還能夠產(chǎn)生功能性的特定糖基化的重組IgM變異體，目前用于制造抗埃博拉病毒的單克隆抗體[27]。

與昆蟲(chóng)細(xì)胞相似，植物也含有β-己糖胺酶，它能從一些重組糖蛋白中去除谷氨酰胺殘基，并在截短的N-聚糖上暴露末端甘露糖。雖然高爾基體后加工過(guò)程可以通過(guò)相應(yīng)的β-己糖胺酶基因敲除來(lái)預(yù)防，但帶有末端甘露糖殘基的N-糖聚合物是用于酶替代療法治療溶酶體儲(chǔ)存疾病的重組糖蛋白的有益結(jié)構(gòu)。植物生產(chǎn)的重組葡萄糖腦苷脂酶已于2013年被FDA批準(zhǔn)用于治療Gaucher病。這種藥物在基因修飾的胡蘿卜細(xì)胞中表達(dá)，主要含有Man3XylFucGlcNAc2糖，被人體甘露糖受體有效地內(nèi)化。與其他市售重組葡糖腦苷脂酶相比，在生產(chǎn)過(guò)程中，不需要任何體外糖苷酶消化或α-甘露糖苷酶抑制劑生產(chǎn)具有末端甘露糖殘基的N-聚糖。

1.3 其他N-糖基化改造技術(shù)

可以通過(guò)基因技術(shù)引入額外的糖殘基來(lái)設(shè)計(jì)有益的特性，這些糖殘基形成新的識(shí)別位點(diǎn)，或者屏蔽清除的受體結(jié)合位點(diǎn)。例如，通過(guò)增加重組糖蛋白的唾液酸含量來(lái)獲得更好的藥代動(dòng)力學(xué)行為。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及包括酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物在內(nèi)的非哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中都產(chǎn)生了高度唾液化的EPO變體。此外，抗體的唾液酸化被認(rèn)為對(duì)抗炎癥的特性起著重要作用。然而，在這種情況下，唾液酸化IgG的潛在用途仍然存在爭(zhēng)議，因?yàn)橛糜谶M(jìn)行研究的糖基化蛋白往往是異質(zhì)的。在優(yōu)化活性的糖基化基因技術(shù)中，不需要的糖基轉(zhuǎn)移酶通常被滅活以防止單糖轉(zhuǎn)移到聚糖結(jié)構(gòu)中。去除核心α-1，6-巖藻基轉(zhuǎn)移酶技術(shù)被用于產(chǎn)生缺少核心巖藻糖的N-聚糖的CHO細(xì)胞。另一種方法可以改變特定核苷酸糖的濃度，例如，通過(guò)相應(yīng)核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)子的失活、過(guò)度表達(dá)或核苷酸糖流量的代謝控制。已有研究表明，N-聚糖的分支對(duì)UDP N-乙酰葡糖胺(N-GlcNAc)濃度的變化很敏感，UDP-GlcNAc被參與復(fù)雜N-聚糖形成和N-聚糖分支起始的酶用作供體底物。由于UDP-GlcNAc水平依賴于己糖胺途徑，代謝控制可用于修飾N-聚糖分支，這可產(chǎn)生增加唾液酸和延長(zhǎng)半衰期的治療性蛋白質(zhì)藥物。

哺乳動(dòng)物的N型糖基化蛋白表達(dá)途徑已被設(shè)計(jì)成大腸桿菌表達(dá)，重組糖蛋白的N-糖基化途徑已被基本闡明。這種糖基化基因技術(shù)的嘗試非常有發(fā)展前途，但目前受到所用細(xì)菌OST的受體位點(diǎn)特異性的限制。優(yōu)化蛋白質(zhì)基因序列將有助于克服這些瓶頸。

合成和半合成方法已被應(yīng)用于優(yōu)化重組蛋白質(zhì)上的N-糖基化，并生成具有特定聚糖結(jié)構(gòu)的均質(zhì)糖蛋白。體外方法包括完全化學(xué)合成糖蛋白法，如唾液酸化EPO或涉及細(xì)胞生成，隨后進(jìn)行化學(xué)或酶后修飾以獲得均勻的糖蛋白。最近，體外孵育的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶及其相應(yīng)的核苷酸糖(UDP-Gal, CMP-Neu5Ac)可以被用來(lái)增加唾液酸含量和商業(yè)化靜脈免疫球蛋白(IVIg)的均一性。在體外生產(chǎn)過(guò)程中α-神經(jīng)氨酸酶、β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖酶被重組葡糖腦苷酶上暴露的甘露糖殘基利用產(chǎn)生N-聚糖。除了對(duì)現(xiàn)有N-聚糖進(jìn)行逐步修飾外，還采用酶法去除異源聚糖和體外酶法轉(zhuǎn)移添加的低聚糖構(gòu)建均勻的唾液酸化IgG-FC片段，用以研究唾液酸化的抗炎作用 。重組糖蛋白在真核細(xì)胞甚至基因工程細(xì)菌中分泌，可以產(chǎn)生不同的N-糖基化。不同種細(xì)胞N-聚糖被特異性內(nèi)糖苷酶酶切去除，留下含有單個(gè)N-連接的乙酰葡糖胺的糖蛋白。酶促轉(zhuǎn)糖基化是將結(jié)構(gòu)均一的、預(yù)合成的低聚糖添加到N-連接的乙酰葡糖胺中，產(chǎn)生具有特定N-聚糖的糖蛋白。雖然通過(guò)這種化學(xué)酶再加工策略可以在糖蛋白上生成均一的聚糖，但在工業(yè)化生產(chǎn)中仍然使用半合成法生產(chǎn)治療性糖蛋白藥物。

Callewaert小組最近開(kāi)發(fā)了一種類似體內(nèi)加工人體細(xì)胞N-聚糖蛋白的系統(tǒng)。在糖刪除策略中，基因技術(shù)將內(nèi)糖苷酶介導(dǎo)的酶法去除N-聚糖過(guò)程加到GnTI缺陷的HEK293細(xì)胞中，使高爾基體中生成N-乙酰葡糖胺修飾的糖蛋白。內(nèi)源性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶可進(jìn)一步拉長(zhǎng)N-連接的乙酰葡糖胺，產(chǎn)生3個(gè)被截短的N-連接的乙酰葡糖胺。在糖刪除系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組抗體顯示出的特殊特征，需要進(jìn)一步測(cè)試，以充分評(píng)估這種新的糖基因技術(shù)的應(yīng)用情況。

2 O-糖基化的工程化改造

哺乳動(dòng)物分泌的蛋白中有不同類型的O-糖基化(例如，O-連接巖藻糖、葡萄糖、甘露糖、木糖或乙酰半乳糖胺)。高濃度粘蛋白型O-聚糖的形成是由多肽乙酰半乳糖胺-轉(zhuǎn)移酶家族啟動(dòng)的。在這種常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物O-糖基化過(guò)程中，高爾基體中的多肽乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶將單個(gè)乙酰半乳糖胺殘基轉(zhuǎn)移到完全折疊的蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)不能顯示明確的一致序列。隨后的逐步延伸通常由不同的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行，從而形成高度多樣的核心O-聚糖結(jié)構(gòu)。

值得注意的是，不同的O-聚糖對(duì)藥物治療效果的貢獻(xiàn)(例如，含有單一O-聚糖的EPO)仍然沒(méi)有得到很好的研究。因此，O-聚糖基因工程技術(shù)的具體目標(biāo)明顯不如N-聚糖化技術(shù)。開(kāi)發(fā)能夠產(chǎn)生特定O-聚糖的系統(tǒng)對(duì)于提高對(duì)糖蛋白治療中O-聚糖作用的理解至關(guān)重要。例如，IgA抗體作為一種新的抗感染或殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物具有很高的潛力。IgA1抗體鉸鏈區(qū)O-聚糖殘基的高度唾液酸化結(jié)構(gòu)的基因克隆技術(shù)為優(yōu)化重組IgA1類治療藥物的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)行為提供了一個(gè)有趣的靶點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的粘蛋白型O-糖基化通常在位點(diǎn)占據(jù)的頻率上變化，使蛋白為顯示不同結(jié)構(gòu)的混合物。在人類細(xì)胞中，同種粘蛋白型O-聚糖的產(chǎn)生受到競(jìng)爭(zhēng)性糖基轉(zhuǎn)移酶的極大限制。昆蟲(chóng)細(xì)胞可以產(chǎn)生一些粘蛋白類型的修飾，但也可以產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)多樣的非人類的O-聚糖，包括巖藻糖和己糖酸的結(jié)合，以及更多的磷膽堿或硫酸鹽替代品。與動(dòng)物細(xì)胞相比，酵母和植物中不包含典型的粘蛋白型O-糖基化合成系統(tǒng)，這使得這些哺乳動(dòng)物型O-聚糖的合成不受內(nèi)源性糖基轉(zhuǎn)移酶的任何干擾。然而，來(lái)自畢式酵母的重組EPO含有兩個(gè)甘露糖殘基，連接到126位絲氨酸的單O-糖基化位點(diǎn)。這些O-甘露糖結(jié)構(gòu)不同于哺乳動(dòng)物α-二糖聚糖型O-甘露糖基化，當(dāng)其存在于重組糖蛋白上時(shí)可能會(huì)引起不期望的副作用。植物可以將與重組蛋白O-糖基化位點(diǎn)相鄰的暴露脯氨酸殘基轉(zhuǎn)化為羥基脯氨酸殘基，它可以被阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步修飾，產(chǎn)生小阿拉伯糖鏈[31]。

在哺乳動(dòng)物中，對(duì)粘蛋白O型糖基化起始和延伸的控制是復(fù)雜的，還沒(méi)有建立用于控制附著第一個(gè)單糖基因的共有序列，而有益于位點(diǎn)特異性O(shè)-糖基化的因素并不是很清楚。人多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶家族由20個(gè)成員組成，它們差異表達(dá)，顯示出不同的和重疊的肽-受體-底物特異性。CHO細(xì)胞主要產(chǎn)生核心1結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可用于產(chǎn)生特定的和拉長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)。消除O-聚糖異質(zhì)性的策略包括在不能產(chǎn)生粘性蛋白的非哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)重組糖蛋白，或系統(tǒng)地消除在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)或延長(zhǎng)O-聚糖的酶[32]。

新的O-聚糖基化基因克隆技術(shù)已在酵母和植物細(xì)胞中成功應(yīng)用。粘蛋白型核心O-聚糖，是在釀酒酵母細(xì)胞中人粘蛋白衍生肽上生成的。用于O-連接的乙酰半乳糖胺形成的機(jī)制已在植物中成功表達(dá)，并且有效地在本塞姆氏煙草產(chǎn)生的人EPO-Fc上產(chǎn)生二唾液酸化的核心O-聚糖。避免酵母非期望的O-甘露糖基化的策略涉及α-甘露糖苷酶的表達(dá)的基因工程技術(shù)。這種方法將產(chǎn)生單個(gè)O-連接的甘露糖，其可以通過(guò)哺乳動(dòng)物類型的修飾進(jìn)一步延長(zhǎng)，例如產(chǎn)生α-三聚糖聚糖型O-聚糖?；蛘?，可以通過(guò)用重組溶酶體甘露糖苷酶體外消化巴斯德畢赤酵母生成的糖蛋白來(lái)除去甘露糖殘基，或者可以通過(guò)抑制所涉及的蛋白質(zhì)O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)防止O-連接的甘露糖鏈的產(chǎn)生。在半合成O-聚糖基化基因工程方法中，在大腸桿菌中表達(dá)的多肽乙酰半乳糖胺-轉(zhuǎn)移酶，可在重組蛋白上啟動(dòng)粘蛋白型O-糖基化。在體外應(yīng)用聚糖的PEG化技術(shù)進(jìn)一步修飾含有乙酰半乳糖胺的蛋白質(zhì)可以增加蛋白質(zhì)半衰期。已經(jīng)使用類似的策略將PEG修飾的唾液酸連接到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的重組血液因子FⅧ的O-聚糖上。

3 展望

近年來(lái)，制藥行業(yè)已經(jīng)在開(kāi)發(fā)新型糖蛋白治療方面付出了相當(dāng)大的努力。 現(xiàn)有多種使用不同技術(shù)生成的糖基化基因工程技術(shù)的單克隆抗體藥物，處于不同的臨床試驗(yàn)階段。用于IgG1表達(dá)的細(xì)胞糖基因技術(shù)主要集中在從重鏈Fc區(qū)中的天冬酰胺Asn297處的N-聚糖中消除核心-巖藻糖。 缺乏核心-巖藻糖增加了對(duì)Fcg RIII受體結(jié)合的親和力，從而改善了對(duì)天然殺傷細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性。類似的糖基化依賴機(jī)制影響巨噬細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用，并影響病毒中和抗體的受體介導(dǎo)效應(yīng)器功能。用于治療埃博拉病毒感染和逆轉(zhuǎn)疾病的ZMAPP抗體混合物包含3種植物產(chǎn)生的缺乏核心巖藻糖殘基抗體。在小鼠中，無(wú)巖藻糖的單克隆抗體13F6(ZMAPP成分之一)與含有巖藻糖核心的13F6變體相比，顯示出明顯增強(qiáng)的抗埃博拉病毒效力。這些例子清楚地證明了糖基化的影響，并突出了糖化工程單抗在人類中不同的應(yīng)用潛力。因此，在不久的將來(lái)，批準(zhǔn)用于不同疾病治療的糖基化單克隆抗體的數(shù)量有望增加[33]。除了調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能外，未來(lái)的糖基化修飾策略還將集中在增強(qiáng)抗體抗炎特性的基因工程技術(shù)。具有大量末端唾液酸的IgG糖型對(duì)凝集素型受體的親和力增強(qiáng)，可能是下一代抗體發(fā)展的另一個(gè)新領(lǐng)域?；蚣夹g(shù)可以使治療抗體藥物、半衰期增強(qiáng)的重組糖蛋白藥物以及用于酶替代的不同重組產(chǎn)品完全人源化糖基化[34]。

盡管我們還不完全了解影響和控制真核細(xì)胞表達(dá)糖基化蛋白的所有因素，但過(guò)去在宿主細(xì)胞中表達(dá)均一糖基化蛋白的基因技術(shù)方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。利用基因組編輯工具，廣泛整合分析數(shù)據(jù)，理解細(xì)胞過(guò)程，將有助于開(kāi)發(fā)下一代表達(dá)特定重組糖蛋白藥物的表達(dá)宿主。這些糖基化基因技術(shù)將使生物類似藥的生產(chǎn)更容易，并產(chǎn)生新一代具有生物活性更好、改變糖基化、優(yōu)化療效和安全性的藥物[35]。

糖基化在重組糖蛋白生物制藥中的重要性越來(lái)越受到人們的重視，目前學(xué)術(shù)界和工業(yè)界都在為控制糖基化提供強(qiáng)有力的解決方案。細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)基因技術(shù)的最新進(jìn)展表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物等不同的系統(tǒng)中，可以表達(dá)特定和均一的N-聚糖結(jié)構(gòu)蛋白。通過(guò)使用CRISPR/Cas等基因組編輯工具，可以消除物種和細(xì)胞類型的現(xiàn)有差異和缺點(diǎn)，并且在特定糖蛋白(如單克隆抗體、EPO)上產(chǎn)生已定義的N-聚糖的許多重塑工具已經(jīng)用在不同的表達(dá)平臺(tái)。通過(guò)使用CRISPR/Cas等基因組編輯工具，可以消除物種和細(xì)胞類型的差異和缺點(diǎn)，并且許多糖基修飾基因技術(shù)在不同的表達(dá)平臺(tái)上應(yīng)用可以表達(dá)特定糖蛋白(如單克隆抗體、EPO)。最終目標(biāo)將是建立生產(chǎn)平臺(tái)，用于生產(chǎn)所需結(jié)構(gòu)的特定N-糖基化的重組糖蛋白藥物。目前，這種“按需”N-聚糖基化包括有高度唾液酸化的四觸角復(fù)合物N-聚糖、末端唾液酸化的雙三元N-聚糖和缺乏巖藻糖的雙三元N-聚糖。此外，有可能產(chǎn)生均一的低聚甘露糖苷結(jié)構(gòu)，如特定的O-連接聚糖[36]。生產(chǎn)已定義的聚糖糖蛋白的方法將推動(dòng)對(duì)聚糖功能的理解，從而為治療性糖蛋白藥物的糖基化基因技術(shù)提供新的靶點(diǎn)。

目前,我們還不了解大多數(shù)真核細(xì)胞中導(dǎo)致聚糖多樣性的所有途徑，對(duì)參與N-和O-糖基化(OST復(fù)合物和多肽乙酰葡糖胺-轉(zhuǎn)移酶)起始的關(guān)鍵酶的認(rèn)識(shí)也很有限。此外，由于很難制備具有長(zhǎng)末端延伸的N-聚糖，如聚唾液酸化，這可能會(huì)顯著延長(zhǎng)半衰期。這種廣泛的修飾可能取決于未知的因素，這些因素可能包括調(diào)節(jié)在高爾基體的保持或接觸時(shí)間。更好地描述細(xì)胞因素，如高爾基體組織和貨物的運(yùn)輸過(guò)程，對(duì)于克服當(dāng)前的一些局限性至關(guān)重要。此外，利用現(xiàn)有的體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)，很難實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性N-糖基化和N-聚糖制備,需要更多的研究來(lái)了解蛋白質(zhì)內(nèi)在影響特定聚糖與多肽序列和結(jié)構(gòu)關(guān)系的因素，以及其他未知位點(diǎn)特異性糖基化方面的因素。與其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)一起，分子動(dòng)力學(xué)模擬將非常適合于研究碳水化合物-蛋白質(zhì)的相互作用，并使開(kāi)發(fā)N-聚糖的位點(diǎn)特異性再修飾策略成為可能。研究結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的蛋白質(zhì)工程改變糖基化酶,如OST催化亞單位或聚糖加工酶的底物特異性，可為細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)中的位點(diǎn)特異性工程提供額外的工具。改變糖基化酶如OST催化亞單位或聚糖加酶的底物特異性的結(jié)構(gòu)引導(dǎo)蛋白質(zhì)的基因技術(shù)，可為細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)中的位點(diǎn)特異性的基因技術(shù)提供額外的工具。位點(diǎn)特異性修飾可以通過(guò)高級(jí)化學(xué)酶完成或用精確控制所附的聚糖結(jié)構(gòu)來(lái)完成糖原蛋白的從頭合成。生物制藥工業(yè)或?qū)μ囟▽?shí)驗(yàn)室領(lǐng)域仍有興趣采取這種復(fù)雜且費(fèi)用高昂的辦法。

未來(lái)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是嘗試協(xié)調(diào)N-和O-聚糖糖基化的基因工程技術(shù)。到目前為止，只有理論研究證明了兩種糖基化協(xié)調(diào)修飾途徑的可行性。由于需要同時(shí)設(shè)計(jì)兩條在同一亞細(xì)胞間隔中和利用相同核苷酸糖供體途徑的基因技術(shù)，所以在制備條件下對(duì)這些修飾的控制將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。更好地理解細(xì)胞生物學(xué)，如通過(guò)高爾基體的貨物運(yùn)輸過(guò)程，以及開(kāi)發(fā)用于引導(dǎo)核苷酸糖底物和加工酶工具，將是干擾不同細(xì)胞過(guò)程的更復(fù)雜方法的基礎(chǔ)。最終，需要將實(shí)驗(yàn)獲得的參數(shù)引入穩(wěn)健模型中，以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)重組糖蛋白生物藥物的N-和O-聚糖分布。鑒于治療性的糖蛋白藥物具有巨大的潛力，生物制藥行業(yè)應(yīng)擴(kuò)大其在糖蛋白基因工程方面的努力，以促進(jìn)具有特定性質(zhì)和功能的下一代藥物的開(kāi)發(fā)。