基于低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)定性和定量分析羅非魚各組織的方法探究

劉宏亮,丁倩雯,TSEGAY Teame,郝強(qiáng),王安然,馬德銘,冉超,楊雅麟,張震*,周志剛*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所水產(chǎn)動(dòng)物飼料創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京 100081；2.北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院量子電子學(xué)研究所，北京 100871

在水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)和飼料研究中，選擇合適的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)有效地評(píng)定營(yíng)養(yǎng)素的作用和指導(dǎo)配合飼料的生產(chǎn)尤為重要。形體指標(biāo)的檢測(cè)是魚類常規(guī)營(yíng)養(yǎng)評(píng)定的重要組成部分，包括含肉率、臟體比、脂體比等。含肉率是衡量魚類生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)之一，受魚的種類、生活環(huán)境、餌料等影響[1]；脂體比檢測(cè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義，由于蛋白質(zhì)原料的缺乏，水產(chǎn)養(yǎng)殖中高脂飼料的應(yīng)用越來(lái)越普遍，造成魚體脂肪組織過(guò)量蓄積及魚類營(yíng)養(yǎng)性疾病頻發(fā)[2]，其中魚類脂肪組織主要是指腹腔脂肪組織[3-4]；臟體比能夠反映魚類營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。目前，魚類營(yíng)養(yǎng)研究中，魚類含肉率的檢測(cè)是測(cè)定魚體重后，去除鰓、鰭、骨板、內(nèi)臟和骨骼等非肉質(zhì)部分，稱量各部分重量，計(jì)算出魚體肌肉占體重的百分比[1]；脂體比的檢測(cè)是測(cè)定魚體重后解剖取腹腔脂肪組織稱重，計(jì)算出脂肪組織占體重的百分比[5]；臟體比是解剖魚體稱量?jī)?nèi)臟，計(jì)算出內(nèi)臟占體重的百分比?？梢钥闯觯误w指標(biāo)的常規(guī)測(cè)定需要解剖魚體，會(huì)造成樣品損失，而且耗時(shí)耗力。因此，建立無(wú)損快速檢測(cè)技術(shù)來(lái)定量分析各組織含量是魚類營(yíng)養(yǎng)評(píng)定中的重要需求。

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)具有快速、無(wú)損的特點(diǎn)[6]。樣品中處于不同能態(tài)的氫質(zhì)子比例符合玻爾茲曼平衡，對(duì)樣品施加射頻脈沖后，低能態(tài)氫質(zhì)子向高能態(tài)躍遷，停止脈沖射頻后，氫質(zhì)子回到基態(tài)恢復(fù)玻爾茲曼平衡，這個(gè)過(guò)程所需要的時(shí)間被稱為馳豫時(shí)間[7-8]，包括縱向弛豫時(shí)間(T1)和橫向弛豫時(shí)間(T2)[9]。1H低場(chǎng)核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)快速無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于食品、高分子、石油、醫(yī)藥等領(lǐng)域的工業(yè)質(zhì)量控制中，用于測(cè)定各種材料的固液比和油水比，如含油巖石、食品乳劑和植物種子等[10]。弛豫時(shí)間分布實(shí)驗(yàn)包括簡(jiǎn)單、快速的一維實(shí)驗(yàn)以及更為復(fù)雜的多維實(shí)驗(yàn)。一維實(shí)驗(yàn)使用脈沖之間的恒定間隔，允許評(píng)估縱向或橫向弛豫；而在多維實(shí)驗(yàn)中，信號(hào)是作為2個(gè)或多個(gè)自變量的函數(shù)測(cè)量的，允許自旋系統(tǒng)在不同弛豫機(jī)制下演化[11]。常用的一維工具是基于90°脈沖后自由感應(yīng)衰減信號(hào)的采集，如脈沖序列自旋回波、脈沖場(chǎng)梯度自旋回波、自旋回波、反演/飽和恢復(fù)[12]。有研究人員提出了新的二維(two-dimension，2D)弛豫時(shí)間分布脈沖序列，包括T1-T2[11]、T2-store-T2[13]和T2-D[14]。其中，低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)已被應(yīng)用于油菜籽成分分析[12]和巖石含油分析[15]。

近年來(lái)，核磁共振分析逐漸被應(yīng)用于水產(chǎn)相關(guān)研究中，如利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)分析水產(chǎn)品干燥過(guò)程中的水分含量[16]、研究水產(chǎn)品蛋白質(zhì)變性[17]、預(yù)測(cè)水產(chǎn)品理化指標(biāo)[18-19]以及檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物脂肪體積[3-4,20]。由此可知，核磁共振分析主要被應(yīng)用于水產(chǎn)品加工的相關(guān)研究中，在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)相關(guān)研究中的應(yīng)用較少，而且多是基于一維核磁技術(shù)和核磁成像技術(shù)，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2二維譜技術(shù)對(duì)魚類組織進(jìn)行定性及定量分析尚未見報(bào)道?；诖?，本研究以羅非魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)對(duì)羅非魚組織進(jìn)行定性和定量分析的可行性。首先，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)對(duì)羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進(jìn)行定性分析；然后采用組織混合模擬活體，進(jìn)一步驗(yàn)證各組織信號(hào)能否實(shí)現(xiàn)分離鑒定；隨后對(duì)能夠?qū)崿F(xiàn)分離的組織信號(hào)建立定量分析的模型，并驗(yàn)證其可靠性，以期推進(jìn)利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)確定組織含量的快速無(wú)損技術(shù)在魚類營(yíng)養(yǎng)代謝研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚購(gòu)自北京超市發(fā)超市。

SPEC-RE1-3D型核磁共振分析儀(北京斯派克科技發(fā)展有限公司)，相關(guān)參數(shù)為：磁場(chǎng)強(qiáng)度：0.5 T；氫質(zhì)子共振頻率：21 MHz；磁體溫度：37 ℃；樣品測(cè)試區(qū)域：20 mm×20 mm(高×直徑)圓柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)檢測(cè)的一般步驟 將水模標(biāo)準(zhǔn)樣置入試管后插入核磁共振探頭中，在核磁共振2D(nuclear magnetic resonance 2D，NMR 2D)掃描軟件上選擇氫火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)脈沖序列，點(diǎn)擊頻率搜索功能，獲取設(shè)備氫核共振頻率，繼續(xù)點(diǎn)擊脈沖寬度搜索功能，獲取90°及180°激勵(lì)脈沖的寬度。隨后，取出水模標(biāo)準(zhǔn)樣，將待測(cè)樣品放入核磁試管并置于核磁共振探頭中，在NMR 2D掃描軟件中選擇T1-T2脈沖序列，設(shè)置飽和恢復(fù)時(shí)間最小值(TIMin)為100 μs，飽和恢復(fù)時(shí)間最大值(TIMax)為2 000 000 μs，以TIMin至TIMax對(duì)數(shù)分布31個(gè)不同的飽和恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)各飽和恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)的回波串信號(hào)。儀器主要測(cè)試參數(shù)如下：90°脈沖寬度15 μs；180°脈沖寬度30 μs；探頭穩(wěn)定時(shí)間10 μs；濾波器穩(wěn)定時(shí)間10 μs；回波間隔300 μs；磁場(chǎng)主頻19.42 MHz；濾波器帶寬10 000 Hz；采樣間隔4 μs；回波采樣點(diǎn)數(shù)1；采集回波個(gè)數(shù)4 096；掃描次數(shù)8。

數(shù)據(jù)采集結(jié)束后使用T1T2Inv反演軟件對(duì)采集的信號(hào)進(jìn)行T1-T2二維譜分析，獲取被測(cè)樣品的T1弛豫時(shí)間、T2弛豫時(shí)間以及T1/T2比值。T1-T2二維譜中橫坐標(biāo)為T2弛豫時(shí)間，縱坐標(biāo)為T1弛豫時(shí)間，以不同顏色表示核磁共振信號(hào)幅度值(無(wú)因次)。

1.2.2羅非魚掃描檢測(cè) ①組織定性：將羅非魚(2 kg)麻醉后，取羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織，去除其他組織殘留，根據(jù)1.2.1中操作步驟分別對(duì)肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進(jìn)行定性分析；

②定性分離驗(yàn)證：將①中的4種組織混合模擬活體，根據(jù)1.2.1中步驟進(jìn)行操作，驗(yàn)證利用低場(chǎng)核磁T1-T2譜技術(shù)分離組織的可靠性；

③組織標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：根據(jù)②的結(jié)果，將可分離組織取梯度重量，進(jìn)行掃描反演分析，計(jì)算各梯度對(duì)應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，制作“梯度重量-信號(hào)強(qiáng)度”標(biāo)準(zhǔn)曲線；

④活體應(yīng)用：羅非魚(初始體重0.6±0.05 g)養(yǎng)殖2周(循環(huán)水養(yǎng)殖，每天投喂2次羅非魚商品飼料，每頓投喂量為初始體重3%)，取羅非魚全魚稱重后進(jìn)行掃描反演，分析各組織對(duì)應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算組織重量，分析組織重量與魚體重相關(guān)性。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均來(lái)自至少3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，使用軟件T1T2Inv反演軟件對(duì)采集的信號(hào)進(jìn)行T1-T2二維譜分析，Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行計(jì)算，Graphpad Prism 5.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織的離體定性分析

為了對(duì)羅非魚組織進(jìn)行低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)掃描反演定性分析，解剖羅非魚，取肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織，將4種組織分別放進(jìn)核磁共振分析儀中利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)掃描并反演成像，通過(guò)反演軟件計(jì)算得到各組織縱向弛豫時(shí)間T1分布、橫向弛豫時(shí)間T2分布以及縱向弛豫時(shí)間峰值(峰值表示信號(hào)達(dá)到最高峰對(duì)應(yīng)的弛豫時(shí)間值)與橫向弛豫時(shí)間峰值比值(T1/T2)，結(jié)果見表1。根據(jù)4種組織單獨(dú)掃描反演成像結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，4種組織的縱向弛豫時(shí)間T1和橫向弛豫時(shí)間T2有部分重疊；而肌肉組織T1/T2值為12.06±1.07，腹腔脂肪組織T1/T2值為2.05±0.65，肝臟組織T1/T2值為4.9±0.24和腸道組織T1/T2值為5.3±0.3。由此可知，僅根據(jù)4種組織的縱向弛豫時(shí)間T1和橫向弛豫時(shí)間T2不能將羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪、肝臟組織和腸道組織徹底分離，但是根據(jù)4種組織的T1/T2值，能夠?qū)⒓∪饨M織和腹腔脂肪組織徹底分離；而由于肝臟組織和腸道組織的T1、T2重疊及T1/T2值相近，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)不能區(qū)分羅非魚肝臟組織和腸道組織。

表1 羅非魚組織定性分析Table 1 Qualitative analysis of tilapia tissues

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號(hào)幅度值。圖1 利用核磁共振T1-T2譜技術(shù)掃描羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織反演圖Fig.1 The muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue, and intestinal tissue of tilapia were scanned by nuclear magnetic resonance T1-T2 spectroscopy

2.2 各組織混合模擬活體檢測(cè)二維1H LF-NMR定性可靠性

根據(jù)2.1的結(jié)果可知，在低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)掃描下，羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、腸道組織和肝臟組織具有不同的組織特性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)分離羅非魚組織的可靠性，解剖羅非魚(約2 kg)，取肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織，并混合，使用T1-T2聯(lián)合掃描分析。結(jié)果顯示，反演圖中有3個(gè)信號(hào)區(qū)域，分別為T1/T2=2.6，T1/T2=5，T1/T2=11(圖2)。根據(jù)表1中4種組織的T1/T2值，T1/T2=2.6區(qū)域?yàn)楦骨恢窘M織信號(hào)區(qū)域，T1/T2=5區(qū)域?yàn)楦闻K或者腸道的信號(hào)區(qū)域，T1/T2=11區(qū)域?yàn)榧∪饨M織信號(hào)區(qū)域。這一結(jié)果顯示，采用低場(chǎng)核磁共振T1-T2聯(lián)合掃描能夠?qū)⒓∪饨M織和腹腔脂肪組織分離，而肝臟組織和腸道組織信號(hào)重疊，無(wú)法區(qū)分。由上述結(jié)果可知，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)能夠在混合組織中準(zhǔn)確識(shí)別肌肉組織和腹腔脂肪組織。

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號(hào)幅度值。圖2 羅非魚肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織和腸道組織混合進(jìn)行T1-T2聯(lián)合掃描Fig.2 Tilapia muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue and intestinal tissue were mixed for T1-T2 combined scanning

2.3 羅非魚肌肉、腹腔脂肪組織定量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

綜合2.1和2.2的結(jié)果，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)可以定性分離羅非魚的肌肉組織和腹腔脂肪組織。為了分析組織信號(hào)強(qiáng)度與組織重量之間是否存在聯(lián)系，取羅非魚組織梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)進(jìn)行T1-T2聯(lián)合掃描后反演，分析區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度與肌肉組織重量之間的關(guān)系，掃描結(jié)果顯示肌肉區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度與肌肉組織重量線性相關(guān)，R2=0.974 3(圖3)；取羅非魚腹腔脂肪組織梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)進(jìn)行T1-T2聯(lián)合掃描后反演，掃描結(jié)果顯示脂肪區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度與脂肪組織重量線性相關(guān)，R2=0.965 0(圖3)。上述結(jié)果說(shuō)明，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2聯(lián)合掃描可以定量分析羅非魚全魚肌肉組織含量及腹腔內(nèi)脂肪組織含量。

圖3 羅非魚離體組織掃描組織區(qū)域信號(hào)大小與組織重量關(guān)系圖Fig.3 The relationship between signal size and tissue weight of tilapia in vitro tissue scanning

2.4 低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)分析在羅非魚全魚中的實(shí)際應(yīng)用

根據(jù)前述結(jié)果，低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)能夠在離體條件下對(duì)羅非魚肌肉組織和腹腔脂肪組織進(jìn)行定性和定量分析。為了驗(yàn)證低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)在羅非魚活體中應(yīng)用的可行性，選取初始體重為(0.6±0.05) g的羅非魚進(jìn)行為期2周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)羅非魚稱重，并利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2技術(shù)掃描羅非魚全魚并反演成像。掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反演圖中出現(xiàn)2個(gè)信號(hào)區(qū)域，一個(gè)信號(hào)區(qū)域T1/T2值為12，另一個(gè)信號(hào)區(qū)域T1/T2值為5(圖4)。結(jié)合組織定性結(jié)果(表1，圖1)可知，T1/T2值=12的信號(hào)區(qū)域?yàn)榧∪饨M織信號(hào)區(qū)域，T1/T2值=5的信號(hào)區(qū)域?yàn)楦闻K組織和腸道組織混合信號(hào)區(qū)域。從全魚掃描反演圖中沒有采集到腹腔脂肪組織信號(hào)。全魚掃描反演結(jié)果說(shuō)明利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2技術(shù)可以從羅非魚全魚中分離肌肉組織，由于肝臟組織和腸道組織T1、T2部分重疊及T1/T2值相近，利用核磁共振T1-T2技術(shù)無(wú)法分離肝臟組織和腸道組織信號(hào)區(qū)域。

注：圖中以不同顏色表示核磁共振信號(hào)幅度值。圖4 羅非魚全魚T1-T2聯(lián)合掃描反演成像圖Fig.4 Tilapia T1-T2 combined scanning inversion image of whole fish

為了驗(yàn)證組織定量結(jié)果的可靠性，利用相關(guān)反演軟件對(duì)肌肉組織信號(hào)區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)定量相關(guān)性曲線計(jì)算肌肉組織重量，將計(jì)算得到的肌肉組織重量與羅非魚體重進(jìn)行相關(guān)性分析(圖5)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算得到羅非魚肌肉組織重量與羅非魚體重有較好的相關(guān)性(R2=0.806 9)。由此可知，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2技術(shù)能夠分離羅非魚全魚肌肉組織，并對(duì)羅非魚全魚肌肉組織進(jìn)行定量分析。

圖5 計(jì)算所得肌肉組織重量/羅非魚體重Fig.5 Calculated muscle mass/tilapia weight

3 討論

核磁共振技術(shù)具有快速無(wú)損檢測(cè)的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域。利用核磁共振技術(shù)對(duì)肌肉組織和脂肪組織的分析在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已有報(bào)道，如根據(jù)組織中氫原子核磁共振特性不同和密度不同，利用核磁共振成像測(cè)量小鼠的脂肪量和肌肉量[21]；利用不同組織在恒定磁場(chǎng)中對(duì)射頻信號(hào)的反應(yīng)不同，結(jié)合低場(chǎng)核磁共振技術(shù)及最小二乘回歸法和主成分回歸法，建立脂肪和瘦肉含量預(yù)測(cè)模型[22]；利用時(shí)域核磁共振(time-domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR)技術(shù)檢測(cè)小鼠體內(nèi)脂肪含量，分析小鼠肥瘦比[2-3]；水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中有利用核磁共振成像技術(shù)分析檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物脂肪體積相關(guān)報(bào)道[3-4,20]。但目前利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)定性和定量分析魚類各組織含量尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)對(duì)羅非魚的肌肉組織、腹腔脂肪組織、肝臟組織、腸道組織進(jìn)行了定性分析，并通過(guò)混合上述4種組織模擬活體檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，表明利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)能夠分離肌肉組織和腹腔脂肪組織，但是無(wú)法分離肝臟組織和腸道組織。隨后對(duì)肌肉組織和腹腔脂肪組織進(jìn)行了定量分析模型建立，發(fā)現(xiàn)組織信號(hào)大小與組織重量有很好的相關(guān)性，其中，肌肉組織相關(guān)性R2=0.974 3，腹腔脂肪組織相關(guān)性R2=0.965 0。為了驗(yàn)證低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)在羅非魚活體中應(yīng)用的可行性，利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2技術(shù)掃描羅非魚全魚，發(fā)現(xiàn)能夠采集到肌肉組織、肝臟組織和腸道組織信號(hào)，但肝臟組織和腸道組織信號(hào)無(wú)法分離。對(duì)于肌肉組織，利用反演軟件計(jì)算肌肉組織區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度并跟據(jù)定量曲線計(jì)算肌肉組織重量，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)計(jì)算所得肌肉組織重量與羅非魚全魚有一定的相關(guān)性(R2=0.806 9)。

本研究在全魚中沒有采集到腹腔脂肪組織信號(hào)，可能是因?yàn)榱_非魚太小，腹腔脂肪組織量太低，在魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)測(cè)量魚體脂肪含量具有可行性。臟體比是指魚類內(nèi)臟占魚體比重，臟體比反映魚類營(yíng)養(yǎng)和健康狀態(tài)[24]，雖然低場(chǎng)核磁共振T1-T2技術(shù)無(wú)法分離肝臟組織和腸道組織，但是可以反映臟體比的大小。與魚類營(yíng)養(yǎng)研究中的形體指標(biāo)檢測(cè)和體成分分析法相比，低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)具有快速無(wú)損以及可重復(fù)、動(dòng)態(tài)檢測(cè)魚體組織含量的優(yōu)勢(shì)。

本研究在活體檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)沒有采集到腹腔脂肪組織信號(hào)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證其應(yīng)用可行性，包括改變羅非魚規(guī)格、構(gòu)建增脂模型等。此外，需要進(jìn)一步使用添加劑改變羅非魚體內(nèi)肌肉量，驗(yàn)證檢測(cè)利用低場(chǎng)核磁共振T1-T2譜技術(shù)定量肌肉組織準(zhǔn)確性與靈敏性；而且，本研究?jī)H在羅非魚中進(jìn)行，在其他魚類或者動(dòng)物中的應(yīng)用也值得探究。