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    蜂蛹多肽對巨噬細胞RAW264.7免疫活性的影響

    2020-12-09 06:03:52趙杰張偉杰陳瑤項清芳趙婷茆廣華馮偉偉仰榴青
    生物技術(shù)進展 2020年5期
    關(guān)鍵詞:蜂蛹分泌量免疫調(diào)節(jié)

    趙杰,張偉杰,陳瑤,項清芳,趙婷,茆廣華,馮偉偉,仰榴青*

    1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

    蜂蛹(bee pupa)為胡蜂、黃蜂、黑蜂、土蜂等野蜂的幼蟲和蛹,蜂蛹含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì),具有增進食欲、改善睡眠、增強體質(zhì)、提高機體免疫力等功效[1]。蜂蛹中蛋白質(zhì)含量達35%~45%,且含有賴氨酸、蘇氨酸和亮氨酸等8種必需氨基酸,是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白質(zhì)資源[2]。蜂蛹多肽具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性。研究表明,蜂蛹多肽純化組分Ⅳ可較好的清除DPPH·自由基、ABTS+·自由基、超氧陰離子和羥基自由基,同時具有螯合Fe2+的能力,說明蜂蛹多肽具有較強的抗氧化能力[3]。胡福良等[4]研究蜂蛹對小鼠S180腫瘤生長的抑制作用,結(jié)果表明,蜂蛹的抑瘤率為64.37%,能顯著延長S180腹水癌荷瘤小鼠的存活期。何娟等[5]采用環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型,研究了高、中、低3個劑量的雄蜂蛹多肽的免疫活性,結(jié)果表明,高劑量雄蜂蛹多肽可明顯提高環(huán)磷酰胺模型小鼠的白細胞數(shù)、網(wǎng)織紅細胞數(shù)和有核細胞數(shù),并能明顯提高有核細胞的DNA合成,表明雄蜂蛹多肽提取物對小鼠具有一定的免疫增強作用。但關(guān)于蜂蛹多肽純化組分的體外免疫調(diào)節(jié)活性的研究尚未見報道。

    免疫應(yīng)答是指機體受抗原性物質(zhì)刺激后,免疫細胞發(fā)生一系列反應(yīng)以排除抗原性異物的過程。巨噬細胞是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)中免疫細胞的重要成員之一,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著較為重要的作用,如免疫防衛(wèi)和維穩(wěn)等,在免疫應(yīng)答過程中,巨噬細胞是最先做出反應(yīng)的細胞種類之一[6]。被激活的巨噬細胞具有吞噬能力,并通過分泌各種免疫活性物質(zhì),加速細胞的免疫反應(yīng)[7-8]。巨噬細胞RAW264.7是被用來研究免疫調(diào)節(jié)的常用細胞株[9]。

    免疫調(diào)節(jié)劑是通過增加、減少或修改機體的免疫反應(yīng)來改變先天免疫和獲得性免疫體系的一類物質(zhì)[10],蜂蛹多肽是將天然蛋白質(zhì)酶解得到的,對機體無毒副作用,因此,對蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)活性的研究具有重要意義。本課題組在前期研究中經(jīng)酶解、純化獲得了一種蜂蛹多肽純化組分BPP-21(數(shù)據(jù)未發(fā)表),本研究通過考察BPP-21對巨噬細胞RAW264.7的細胞活力、吞噬能力、細胞因子分泌能力、NO分泌能力和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,來探究蜂蛹多肽的免疫調(diào)節(jié)活性,以期為研究與開發(fā)蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)劑提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    BPP-21是本課題組在前期研究中由堿性蛋白酶水解蜂蛹蛋白、經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-25凝膠柱分離純化得到的純化組分(數(shù)據(jù)未發(fā)表);小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所;凝膠電泳試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自合肥博美生物技術(shù)有限責(zé)任公司;NO、細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純,購自國藥集團。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    Synergy H4型多功能酶標(biāo)儀(美國Biotek儀器有限公司);MACO-18AIC型孵箱(日本三洋公司);SW-CJ-IFB型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團);37XC倒置生物顯微鏡(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司)。

    1.3 細胞培養(yǎng)流程

    細胞復(fù)蘇:將RAW264.7細胞的凍存管從-80 ℃冰箱中取出,將凍存管中的細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管,添加少量培養(yǎng)液,1 500 r·min-1離心5 min,去除上清液,再加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,混勻后移入培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

    細胞傳代:在超凈臺中棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,加入含10% FBS DMEM培養(yǎng)基,混勻后吸取細胞懸液,轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中,搖勻,于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    細胞凍存:取對數(shù)生長期細胞,在超凈臺中棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,再加入含10% FBS高糖培養(yǎng)基,吹打均勻,轉(zhuǎn)移至離心管中,1 500 r·min-1離心5 min,去除上清液,加入凍存液,混勻后立即吸入凍存管中,凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 BPP-21對RAW264.7細胞活力的影響

    選用正常傳代的RAW264.7巨噬細胞,用倒置顯微鏡觀察細胞密度,調(diào)整細胞密度為1 mL細胞懸液中含有2×105個細胞,取滅菌的96孔板,每孔加入100 μL細胞懸液,于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察細胞生長狀況,若細胞完全貼壁生長,則移除細胞培養(yǎng)液,空白組每孔加入100 μL培養(yǎng)液,實驗組每孔加入100 μL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液,模型對照組每孔加入100 μL 10 μg·mL-1脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液[11-13],每個處理設(shè)置6個平行實驗。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24、48 h后,觀察細胞生長狀況,若生長狀況良好,每孔加入20 μL 1 mg·mL-1MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,待完全溶解后于570 nm處測定OD值。

    1.5 BPP-21對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

    細胞的選擇、密度的調(diào)整、加樣的濃度與方式以及細胞培養(yǎng)方法同1.4。培養(yǎng)24 h后,取出96孔板,小心棄去細胞培養(yǎng)液,每孔加入100 μL 0.05%中性紅溶液,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后,棄去上清液,用PBS溶液清洗3遍,每孔再加入150 μL細胞裂解液,于4 ℃靜置2~3 h,待細胞完全裂解后于540 nm處測定OD值。

    1.6 BPP-21對RAW264.7細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ量的影響

    調(diào)節(jié)細胞密度為1 mL細胞懸液中含有2×105個細胞,接種于24孔板,每孔加500 μL細胞懸液,培養(yǎng)24 h后,小心棄去上清液,空白組每孔加入500 μL培養(yǎng)液,實驗組每孔加入500 μL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液,模型對照組每孔加入500 μL 10 μg·mL-1LPS溶液。培養(yǎng)24 h后,收集上清液,按ELISA試劑盒說明書要求測定各細胞因子水平。

    1.7 BPP-21對RAW264.7細胞分泌NO量的影響

    細胞的選擇、密度的調(diào)整、加樣的濃度與方式和細胞培養(yǎng)方法同1.6。細胞培養(yǎng)24 h后,取出24孔板,收集上清液,按照NO檢測試劑盒要求測定NO含量。

    1.8 BPP-21對RAW264.7細胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

    調(diào)節(jié)細胞密度為1 mL細胞懸液中含有2×105個細胞,接種于6孔板,每孔加2 mL細胞懸液,培養(yǎng)24 h后,小心棄去上清液,空白組每孔加入2 mL培養(yǎng)液,實驗組每孔加入2 mL不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液,模型對照組每孔加入2 mL 10 μg·mL-1LPS溶液。培養(yǎng)24 h后,小心棄去上清液,用PBS溶液洗3遍,每孔加入300 μL細胞裂解液,用細胞SOD和MDA的檢測試劑盒測定SOD活力和MDA含量。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BPP-21對RAW264.7細胞活力的影響

    細胞活力通常采用MTT法進行檢測,圖1為不同濃度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21及10 μg·mL-1LPS分別作用6、12、24和48 h對細胞活力的影響。由圖1可見,與空白組相比,BPP-21在不同濃度下作用6、12、24和48 h對細胞活力均無顯著影響。結(jié)果說明BPP-21不會對細胞產(chǎn)生損傷,造成細胞凋亡。

    注:不同小寫字母表示同一作用時間內(nèi)不同處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖1 BPP-21對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1 Effect of BPP-21 on the viability of RAW264.7 cells

    2.2 BPP-21對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

    巨噬細胞在炎癥的發(fā)生、維持、宿主防御等方面起著至關(guān)重要的作用[14],其吞噬功能是機體最重要的非特異性免疫反應(yīng)之一。圖2為BPP-21對RAW264.7細胞吞噬能力的影響。與空白組和LPS組相比,在25~200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),BPP-21顯著提高了巨噬細胞的吞噬能力(P<0.05)。說明BPP-21可激活巨噬細胞,顯著增強其吞噬能力。

    2.3 BPP-21對RAW264.7細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ水平的影響

    當(dāng)機體受到炎癥損傷和外在病原體攻擊時,會引起細胞分泌IL-6、TNF-α等細胞因子。活化的巨噬細胞可產(chǎn)生多種細胞因子來調(diào)節(jié)細胞和體液免疫反應(yīng),如TNF-α、IL-2和IFN-γ[15-16]。圖3為BPP-21對RAW264.7細胞分泌 IL-2、TNF-α和IFN-γ的影響。結(jié)果表明,與空白組相比,BPP-21可一定程度上促進RAW264.7細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ,BPP-21在25~200 μg·mL-1濃度下可顯著提高IL-2和TNF-α的分泌量(P<0.05),在12.5~200 μg·mL-1濃度下可顯著提高IFN-γ的分泌量(P<0.05);與LPS組相比,BPP-21在200 μg·mL-1濃度下顯著提高IL-2的分泌量(P<0.05),在100和200 μg·mL-1濃度下可顯著提高TNF-α和IFN-γ的分泌量(P< 0.05)。說明BPP-21可激活RAW264.7細胞,使其IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌量顯著增加。

    2.4 BPP-21對RAW264.7細胞分泌NO水平的影響

    NO是一種細胞內(nèi)信號分子,不僅參與許多生理和病理活動,而且是巨噬細胞破壞細菌和腫瘤細胞的主要媒介。因此,NO可作為測定巨噬細胞活化的定量指標(biāo)[17]。圖4為BPP-21對RAW264.7細胞分泌NO的影響。結(jié)果表明,與空白組相比,BPP-21在12.5~200 μg·mL-1濃度下顯著增加了巨噬細胞NO的分泌量(P<0.05);與LPS組相比,BPP-21在100和200 μg·mL-1濃度下顯著提高了NO的分泌量(P<0.05)。說明BPP-21可顯著增強RAW264.7細胞分泌NO的作用。

    2.5 BPP-21對RAW264.7細胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響

    SOD活力表示對自由基的清除能力,可評價抗氧化應(yīng)激能力[18]。MDA是最穩(wěn)定的次生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,它在細胞中引起毒性應(yīng)激,導(dǎo)致組織損傷,而且MDA已被用作細胞中氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物,并已報道存在于多種食品中[19-20]。圖5為BPP-21對RAW264.7細胞內(nèi)SOD活力和MDA含量的影響。與空白組和LPS組相比,在濃度為50~200 μg·mL-1時,細胞SOD活力顯著升高(P<0.05);BPP-21對RAW264.7細胞內(nèi)MDA的含量無顯著影響。說明BPP-21可不同程度提高RAW264.7細胞內(nèi)SOD的活力,并對細胞無明顯氧化損傷作用。

    注:不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖2 BPP-21對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig.2 Effect of BPP-21 on the phagocytosis of RAW264.7 cells

    注:不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3 BPP-21對RAW264.7細胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ的影響Fig.3 Effects of BPP-21 on inducing IL-2, TNF-α, IFN-γ production of RAW264.7 cells

    3 討論

    本文研究了蜂蛹多肽純化組分BPP-21對RAW264.7巨噬細胞的免疫活性的影響。結(jié)果表明,在濃度12.5~200 μg·mL-1范圍內(nèi),BPP-21對RAW264.7巨噬細胞無明顯的細胞毒性作用,并顯著提高IFN-γ與NO的分泌量;在濃度25~200 μg·mL-1范圍內(nèi),顯著增加細胞吞噬能力、IL-2與TNF-α的分泌量;在濃度50~200 μg·mL-1范圍內(nèi),顯著提高細胞內(nèi)SOD的活力。說明BPP-21對RAW264.7巨噬細胞具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。

    巨噬細胞作為吞噬細胞,廣泛分布于全身,在宿主防御中起著重要作用,通過其吞噬功能、細胞毒性和細胞內(nèi)殺傷活性在機體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[21]?;罨木奘杉毎粌H能夠吞噬病原體,還可以分泌調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細胞信使,如炎性介質(zhì)NO、細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ。董曉澤[22]研究了日本黃姑魚皮活性肽對RAW 264.7細胞的免疫活性,結(jié)果表明,日本黃姑魚皮活性肽對RAW 264.7細胞吞噬能力、NO分泌能力和TNF-α、IL-6、IL-12分泌能力的提高具有顯著的促進效果。本研究表明BPP-21對RAW 264.7細胞的吞噬能力以及分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ和NO的能力具有顯著促進作用,說明BPP-21具有較好的免疫活性。

    注:不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖4 BPP-21對RAW264.7細胞分泌NO的影響Fig.4 Effect of BPP-21 on the secretory NO of RAW264.7 cells

    機體產(chǎn)生自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)生成MDA,MDA參與脂質(zhì)自由基的形成和氧的攝取,是內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化物的標(biāo)志[23],測定MDA的量可間接反應(yīng)細胞損傷的程度。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶,它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,還能夠修復(fù)受損細胞,復(fù)原自由基對人及動植物機體造成的損傷[24]。本研究表明BPP-21可提高RAW264.7細胞內(nèi)SOD的活力,對MDA的含量無顯著影響,說明BPP-21對RAW264.7細胞無明顯氧化損傷作用,且可以修復(fù)受損細胞、恢復(fù)氧自由基對細胞的氧化損傷,對細胞具有免疫調(diào)節(jié)活性。

    注:不同小寫字母表示各處理間的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖5 BPP-21對RAW264.7細胞SOD和MDA的影響Fig.5 Effect of BPP-21 on SOD and MDA levels of RAW264.7 cells

    本文主要研究了蜂蛹多肽純化組分BPP-21對RAW264.7巨噬細胞的免疫活性的影響,表明BPP-21具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性,可為研究與開發(fā)蜂蛹多肽免疫調(diào)節(jié)劑提供理論基礎(chǔ),后續(xù)將通過對RAW264.7細胞內(nèi)細胞因子和iNOS mRNA表達量的影響;對MAPKs信號通路受體蛋白和轉(zhuǎn)錄因子表達的影響對其免疫調(diào)節(jié)機制進行深入研究。

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