脂多糖對(duì)氣道上皮細(xì)胞分泌炎癥因子的影響＊

舒 艷，蔡 穎，況九龍

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌330006）

氣道上皮細(xì)胞具有活躍的分泌功能，在外界因素的干預(yù)作用下，可以釋放多種炎癥因子，包括趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1MCP-1），生長(zhǎng)因子如人粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF），其他因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），細(xì)胞間黏附分子（human intercellu-lar adhesion molecule，ICAM），血管細(xì)胞黏附分子等[1-5]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分在人類工作或生活中無(wú)處不在，是一種具有強(qiáng)烈免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和IFN-γ，促進(jìn)TH1型反應(yīng)而抑制TH2型反應(yīng)[6]，LPS還可以誘導(dǎo)CD14和TLR4信號(hào)通路激活固有免疫系統(tǒng)，從而活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB誘發(fā)炎性反應(yīng)[7]。LPS是否通過(guò)影響氣道上皮細(xì)胞MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌，從而參與氣道的炎性反應(yīng)，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用不同濃度LPS干預(yù)氣道上皮細(xì)胞不同時(shí)間后檢測(cè)A549細(xì)胞MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌量的變化，從而為闡述氣道炎性反應(yīng)機(jī)制提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖雙抗DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、LPS、凍存液，均購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司；胎牛血清，浙江天航生物科技有限公司；ELISA試劑盒，上海森熊科技實(shí)業(yè)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基[取含高糖雙抗（抗青霉素及鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基90mL，并加入胎牛血清10mL配成100mL的培養(yǎng)基]；胰酶（準(zhǔn)確稱取胰酶0.25g，并將其溶于100mL PBS溶液中）；LPS（將購(gòu)買的來(lái)源于大腸桿菌O55：B5菌株的脂多糖10mg用PBS稀釋配置成濃度為1mg／mL并分裝至EP管內(nèi)放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，待使用時(shí)解凍并用血清配置成干預(yù)濃度）。

1.2 方法 分別采用煮沸、涮洗、泡酸等物理和化學(xué)方法消毒實(shí)驗(yàn)玻璃器械。在紫外燈消毒超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞換液、傳代、細(xì)胞凍存、細(xì)胞復(fù)蘇及LPS干預(yù)（使脂多糖的終濃度為0、0.1、1.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg／mL和100μg／mL，干預(yù)時(shí)間分別為2、4、8、24、30h）。直接收集藥物干預(yù)后的細(xì)胞上清液，備用于ELISA檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后各因子分泌量的均數(shù)變化趨勢(shì)圖 在LPS干預(yù)濃度為20.0μg／mL，干預(yù)時(shí)間為4h和8h時(shí)，ICAM-1的分泌量達(dá)到峰值，見圖1；LPS干預(yù)濃度為50.0μg／mL，干預(yù)時(shí)間為4h時(shí)，MCP-1的分泌量達(dá)到峰值，見圖2；在其他時(shí)間點(diǎn)及LPS干預(yù)濃度，各炎癥因子分泌量變化趨勢(shì)不明顯，見圖3～5。

圖1 ICAM-1平均數(shù)變化趨勢(shì)圖

2.2 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后各因子分泌量方差分析的結(jié)果 不同濃度LPS在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)干預(yù)A549細(xì)胞后其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LPS能夠干預(yù)TGF-β、TNF-α、MCP-1、ICAM-1、ICAM-2的分泌，見表1。

圖2 MCP-1平均數(shù)變化趨勢(shì)圖

圖3 ICAM-2平均數(shù)變化趨勢(shì)圖

圖4 TGF-β平均數(shù)變化趨勢(shì)圖

圖5 TNF-α平均數(shù)變化趨勢(shì)圖

2.3 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)各因子分泌量達(dá)到最大（?。r(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖 在干預(yù)時(shí)間為30h時(shí)，ICAM-2分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在其余各時(shí)相點(diǎn)，ICAM-2分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在干預(yù)時(shí)間為30h時(shí)，TGF-β有一個(gè)分泌量最小時(shí)的LPS干預(yù)濃度，且其與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在其余各時(shí)相點(diǎn)，TGF-β分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，TNF-α、MCP-1、ICAM-1均存在一個(gè)分泌量達(dá)到最大時(shí)的LPS干預(yù)濃度，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖6～10。

表1 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后炎癥因子變化的結(jié)果（±s）

表1 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后炎癥因子變化的結(jié)果（±s）

2h 4h 8h 24h 30h ICAM-1 0.085 0±0.006 0 0.096 0±0.027 4 0.092 0±項(xiàng)目0.029 9 0.085 0±0.004 4 0.084 0±0.003 1 F 1 081.122 15.393 52.409 451.308 94.776 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ICAM-2 0.118 0±0.005 3 0.117 0±0.008 5 0.117 0±0.006 5 0.117 0±0.008 2 0.117 0±0.009 3 F 71.326 256.959 332.867 994.857 474.568 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MCP-1 0.226 0±0.101 7 0.124 0±0.050 0 0.188 0±0.045 3 0.122 0±0.026 0 0.430 0±0.087 6

續(xù)表1 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后炎癥因子變化的結(jié)果（±s）

續(xù)表1 各個(gè)時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞后炎癥因子變化的結(jié)果（±s）

2h 4h 8h 24h 30h F 47 488.271 11 607.497 8 229.743 3 765.014 645.0項(xiàng)目70 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 TGF-β 0.098 0±0.007 4 0.101 0±0.055 2 0.082 0±0.002 3 0.081 0±0.006 1 0.086 0±0.004 3 F 897.693 42.166 59.714 116.237 238.924 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 TNF-α 0.095 0±0.012 0 0.095 0±0.006 5 0.093 0±0.008 8 0.093 0±0.005 6 0.098 0±0.006 9 F 167.594 67.844 1 273.894 255.865 773.153 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖6 ICAM-1分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖

圖7 ICAM-W分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖

圖8 TGF-β分泌量最大（?。r(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖

圖9 MCP-1分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖

圖10 TNF-α分泌量最大時(shí)與空白對(duì)照組比較的直方圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要是研究不同時(shí)相點(diǎn)不同濃度LPS對(duì)氣道上皮細(xì)胞分泌MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的影響，分析炎癥因子分泌量的變化，從而為探索氣道炎癥機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

研究表明LPS可以通過(guò)TNF-α、IL-1β、誘生型一氧化氮合酶等影響巨噬細(xì)胞功能[8]，而Muller-Decker等[9]在用LPS刺激小鼠舌源性上皮細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LPS并沒(méi)有通過(guò)內(nèi)源性炎癥因子如TNF-α、TGF-β等影響上皮細(xì)胞功能，而本研究發(fā)現(xiàn)LPS可以干預(yù)氣道上皮細(xì)胞對(duì)炎癥因子MCP-1、TGF-β、TNF-α、ICAM-1和ICAM-2的分泌。對(duì)氣道上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預(yù)氣道上皮細(xì)胞分泌MCP-1，在LPS干預(yù)濃度為50.0μg／mL，干預(yù)時(shí)間為4h時(shí)，MCP-1的分泌量達(dá)到一個(gè)峰值，與上述結(jié)果相似；而且在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，都存在一個(gè)最佳的LPS干預(yù)濃度使MCP-1的分泌量達(dá)到最大，這就說(shuō)明MCP-1可能在氣道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥的過(guò)程中起著重要作用。用LPS作為刺激因素建造的人體或是動(dòng)物呼吸系統(tǒng)損傷模型都是以支氣管肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞灌注和炎癥因子分泌增多為特征的，而且這個(gè)特征已經(jīng)被用于檢測(cè)新的抗炎藥物[10]；激活的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生炎癥因子如TNF-α和IL-1β，這些炎癥介質(zhì)又可以誘導(dǎo)包括IL-6在內(nèi)的其他炎癥因子的釋放[11]；本研究也發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預(yù)氣道上皮細(xì)胞TNF-α的分泌，且TNF-α的分泌量與LPS的干預(yù)濃度有關(guān)，在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，都存在一個(gè)最佳的LPS干預(yù)濃度，與上述結(jié)果基本一致。牟海波等[12]研究發(fā)現(xiàn)在樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入TGF-β能夠培養(yǎng)出更為幼稚的樹突狀細(xì)胞，且此種細(xì)胞對(duì)LPS的刺激呈現(xiàn)一種低反應(yīng)性；近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)LPS可以通過(guò)LPS結(jié)合蛋白促進(jìn)細(xì)胞釋放炎癥因子TGF-β和IFN-γ[13]；本研究結(jié)果跟上述結(jié)果基本一致，本研究也發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預(yù)氣道上皮細(xì)胞分泌TGF-β；萬(wàn)力等[14]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度（0.005～0.100μg／mL）LPS干預(yù)并傳代后成纖維細(xì)胞TGF-β分泌量增加的同時(shí)，IFN-γ分泌量降低，且呈量效依賴關(guān)系，隨著LPS干預(yù)濃度的增加（0.5μg／mL），上述干預(yù)作用開始下降，當(dāng)刺激濃度達(dá)到1.0μg／mL時(shí)，則呈相反作用，也就是說(shuō)TGF-β分泌量下降而IFN-γ分泌量開始升高；本研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β的分泌量跟LPS的干預(yù)濃度有關(guān)，而且跟LPS的干預(yù)時(shí)間也有關(guān)系，干預(yù)時(shí)間為24h內(nèi)（包括24h）時(shí)，TGF-β的分泌量達(dá)到最大有一個(gè)最佳的LPS干預(yù)濃度，而在干預(yù)時(shí)間為30h時(shí)，TGF-β的分泌量反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)；而且還有人認(rèn)為TGF-β缺乏的小鼠在生存的3周內(nèi)就會(huì)發(fā)生全身炎性反應(yīng)，而且這種炎性反應(yīng)和小腸上皮細(xì)胞功能紊亂有關(guān)[15]；目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝臟的缺血再灌注損傷的核心仍然是炎性反應(yīng)，主要由炎癥細(xì)胞介導(dǎo)。ICAM-1通過(guò)與其配體LFA-1結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞黏附和活化，使中性粒細(xì)胞牢固地黏附于血管壁；還有研究顯示ICAM-1可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞全層，遷移至肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，釋放蛋白酶和反應(yīng)性氧原子，造成肝細(xì)胞損傷[16]；而在氣道上皮細(xì)胞中對(duì)ICAM炎癥因子家族的研究相對(duì)較少，而本研究對(duì)ICAM-1和ICAM-2同時(shí)做了研究，發(fā)現(xiàn)LPS能夠干預(yù)氣道上皮細(xì)胞分泌ICAM-1和ICAM-2，在LPS干預(yù)濃度為20.0μg／mL，干預(yù)時(shí)間為4、8h時(shí)，ICAM-1的分泌量可以達(dá)到峰值，而且在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)，ICAM-1的分泌量均增加，且存在一個(gè)最佳的LPS干預(yù)濃度；而ICAM-2在除干預(yù)時(shí)間為30h以外的各時(shí)相點(diǎn)才和ICAM-1分泌量的變化表現(xiàn)一致。

本研究通過(guò)不同濃度的LPS在不同時(shí)相點(diǎn)干預(yù)A549細(xì)胞，并分析炎癥因子TGF-β、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和ICAM-2分泌量的變化，發(fā)現(xiàn)LPS可以對(duì)氣道上皮細(xì)胞TGF-β，MCP-1，TNF-α，ICAM-1和ICAM-2的分泌量產(chǎn)生影響，而且上述炎癥因子分泌量和LPS的干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)間有關(guān)，這就說(shuō)明氣道炎癥性疾病的發(fā)生與各種損傷性刺激的強(qiáng)度和時(shí)間密切相關(guān)，而且他還提示在疾病發(fā)生的合適時(shí)機(jī)對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)可能會(huì)起到更好的治療作用。

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