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    梨火疫病菌兩個(gè)Sec依賴的外泌纖維素酶鑒定及在侵染梨幼果過程中的基因表達(dá)分析

    2020-12-09 06:03:56嚴(yán)海璘朱宗財(cái)張王斌杜培秀張超趙文軍李為民
    生物技術(shù)進(jìn)展 2020年5期
    關(guān)鍵詞:信號肽葡聚糖毒力

    嚴(yán)海璘,朱宗財(cái),張王斌,杜培秀,張超,趙文軍,李為民*

    1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300; 2.塔里木大學(xué),南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081; 4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176

    梨火疫病(fire blight)是一種毀滅性的植物病害,主要危害仁果類果樹和薔薇科植物。該病害自19世紀(jì)末首次發(fā)現(xiàn)于美國,現(xiàn)已蔓延至歐洲、北非、大洋洲和亞洲等50多個(gè)國家,嚴(yán)重威脅全球蘋果和梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。梨火疫病的病原為梨火疫病菌(Erwiniaamylovora),是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,隸屬于腸桿菌科歐文氏菌屬。因其危害嚴(yán)重,梨火疫病菌名列全球十大植物病原細(xì)菌之一[3],在許多國家和地區(qū)被列為重要的檢疫性病原[4]。梨火疫病菌一般通過自然孔口和傷口作為感染途徑,首先侵入樹木皮層薄壁組織的細(xì)胞間隙,在后期進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管,并能在植物體內(nèi)快速遷移;感病植株最初癥狀表現(xiàn)為水浸狀,隨后出現(xiàn)萎蔫和壞死,受感染的部位變成棕色或黑色,類似火燒一樣,最終導(dǎo)致整棵樹的死亡[5-6]。

    病原菌分泌的致病相關(guān)蛋白也稱為效應(yīng)因子,在與宿主植物互作過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。在革蘭氏陰性菌中,III型分泌系統(tǒng)、IV型分泌系統(tǒng)、Sec依賴分泌途徑和雙精氨酸移位酶途徑(Tat途徑)是效應(yīng)因子輸出的主要通道[9]。其中,Sec分泌途徑包括由3種跨膜蛋白SecY、SecE和SecG組裝的SecYEG通道,在外周膜ATP酶SecA的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)包括毒力因子在內(nèi)的各種蛋白;此外,Sec途徑還包含SecD、SecF和YajC,由這3種膜蛋白參與調(diào)控蛋白質(zhì)的高效輸出[10-11]。Sec分泌蛋白在細(xì)胞質(zhì)中以未折疊前蛋白的形式存在,氨基末端為信號肽(signal peptide, SP),指導(dǎo)前體蛋白經(jīng)由Sec系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。在革蘭氏陰性菌中,前體蛋白跨越細(xì)胞內(nèi)膜,轉(zhuǎn)移至周質(zhì),由胞外信號肽酶I(LepB)或脂蛋白信號肽酶II(LspA)切割SP,并折疊為成熟蛋白;成熟蛋白或者停留在周質(zhì)中,或者轉(zhuǎn)移到次級分泌途徑,如V型分泌系統(tǒng)(type V secretion system,T5SS)、脂蛋白(Lol)途徑或Ⅱ型分泌系統(tǒng)(typeⅡsecretion system,T2SS),并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)為外膜或胞外蛋白[7-8,11]。

    植物病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶是一類重要的致病因子[12-14]。細(xì)胞壁降解酶包括纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶等,在病原菌消解植物抗侵染機(jī)械屏障、入侵寄主等方面發(fā)揮著重要作用。纖維素酶是與致病相關(guān)的主要酶類之一[15-18],已知許多黃單胞菌屬(Xanthomonas)、歐文氏菌屬、青枯菌屬(Ralstonia)的植物病原細(xì)菌,以及絲核菌屬(Rhizoctonia)、稻瘟菌屬(Magnaporthe)的植物病原真菌均分泌纖維素酶[19-22],以此協(xié)助病原自身的入侵與擴(kuò)散。

    迄今為止,關(guān)于梨火疫病菌是否編碼具有分泌特征的纖維素酶類尚不清楚。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酯酶(phosphatase, PhoA)檢測體系,從梨火疫病菌全基因組序列中篩選出2種依賴Sec途徑分泌的纖維素酶EAMY_3602(GenBank:FN434113.1)和EAMY_1236(GenBank:FN434113.1),并對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)分析,以期發(fā)現(xiàn)梨火疫病菌的毒力因子,為梨火疫病的防治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    梨火疫菌株DSM17948由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存,pET-30a質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用試劑盒均購自TaRaKa、TIANGEN、全式金公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1生物信息學(xué)分析 分泌蛋白信號肽的生物信息學(xué)分析基于SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[23]、Lipopversion 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)[24]和Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)[25]完成;Sec依賴分泌蛋白中纖維素酶的篩選參照梨火疫病菌CFBP1430編碼蛋白的功能注釋[26]。

    1.2.2基因克隆 根據(jù)梨火疫病菌CFBP1430 (GenBank:FN434113.1)、EAMY_3602和EAMY_1236編碼基因(分別命名為Ea3602和Ea1236)的核酸序列,設(shè)計(jì)兩對引物3602-F/3602-R和1236-F/1236-R(引物序列見表1)。利用CTAB法提取梨火疫菌株DSM 17948的基因組DNA,以此為模板,利用上述引物分別擴(kuò)增Ea3602和Ea1236,PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化均參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。

    1.2.3PhoA檢測 基于大腸桿菌的PhoA檢測體系由本研究室構(gòu)建[28]。設(shè)計(jì)兩對引物3602SP-F/3602SP-R和1236SP-F/1236SP-R(引物序列見表1),分別以pMD-Ea3602和pMD-Ea1236質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增Ea3602和Ea1236基因的信號肽編碼序列,長度分別為42和60 bp,mphoA載體構(gòu)建和檢測均參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。

    表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

    1.2.4接種梨幼果 梨幼果接種參照嚴(yán)海璘等[27]的方法進(jìn)行。接種后分別在0、8、24 h取樣,用無菌刀片刮取大約0.8 g的剖面組織,于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5總RNA提取與RT-qPCR分析 提取樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以梨火疫菌recA(GenBank: FN434113.1)為內(nèi)參基因[29],利用引物3602-qF/3602-qR、1236-qF/1236-qR(引物序列見表1)分別進(jìn)行Ea3602和Ea1236基因表達(dá)的qPCR分析。具體參照TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)說明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT(Livak)方法計(jì)算相對表達(dá)量,ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組,顯著性差異分析采用Student’st-test[30],P<0.05和P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 篩選梨火疫病菌Sec依賴分泌纖維素酶

    前期研究表明,梨火疫病菌CFBP1430編碼3 393個(gè)蛋白,其中168個(gè)蛋白N末端為SPs,推測其可能通過Sec系統(tǒng)分泌[31]。參照CFBP1430編碼蛋白的功能注釋[26],我們從168種Sec依賴分泌蛋白中進(jìn)一步篩選出2種具有纖維素酶功能的蛋白:EAMY_3602和EAMY_1236,其中前者為內(nèi)切葡聚糖酶,后者為β-葡萄糖苷酶。目前,已有CFBP1430[26]、ATCC49946[32]和E-2[33]共3個(gè)梨火疫病菌菌株完成了全基因組序列測定。Blast分析表明EAMY_3602和EAMY_1236在所有3個(gè)菌株中的同源性均為100%。利用SignalP 4.1、Lipopversion 1.0和Phobius分析進(jìn)一步證實(shí)EAMY_3602和EAMY_1236 N末端為信號肽序列,且均由信號肽酶LepB切割,切割位點(diǎn)分別位于第14個(gè)和20個(gè)氨基酸(表2)。

    2.2 克隆Ea3602和Ea1236基因

    以梨火疫菌株DSM17948的基因組DNA為模板,利用3602-F/3602-R和1236-F/1236-R擴(kuò)增EAMY_3602和EAMY_1236的編碼基因,分別獲得975和2 298 bp的PCR產(chǎn)物(圖1),與預(yù)期結(jié)果大小一致。將目的片段回收、連接,測序結(jié)果確證所擴(kuò)增片段為Ea3602和Ea1236。

    2.3 驗(yàn)證EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性

    為了驗(yàn)證EAMY_3602和EAMY_1236的分泌特性,我們分別將EAMY_3602和EAMY_1236信號肽(3602SP和1236SP)的編碼序列插入pET-mphoA,與mphoA融合,構(gòu)建pET-3602SP-mphoA和pET-1236SP-mphoA(圖2A),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細(xì)胞。PhoA檢測結(jié)果顯示:含有pET-3602SP-mphoA或pET-1236SP-mphoA轉(zhuǎn)化子在指示培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后,呈現(xiàn)藍(lán)色,與陽性對照(含有pET-phoA的BL21細(xì)胞)結(jié)果相似,而陰性對照(帶有pET-mphoA的BL21細(xì)胞)仍保持白色(圖2B)。這一結(jié)果表明3602SP和1236SP能夠引導(dǎo)mphoA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì),由此證實(shí)EAMY_3602和EAMY_1236可通過梨火疫病菌的Sec途徑進(jìn)行分泌。

    表2 梨火疫病菌Sec依賴分泌纖維素酶Table 2 The putative Sec-dependent secreted cellulase identified from E. amylovora

    M—DL 5 000 Marker; 1—Ea3602 的PCR產(chǎn)物;2—Ea1236的PCR產(chǎn)物圖1 Ea3602和Ea1236基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR product of Ea3602 and Ea1236 gene

    2.4 Ea3602和Ea1236在梨火疫病菌侵染幼梨過程中的表達(dá)分析

    為了揭示Ea3602和Ea1236在病原菌侵染過程中的潛在功能,我們用梨火疫病菌接種酥梨幼果,分別在接種后0、8、24 h提取總RNA,利用RT-qPCR分析這兩種纖維素酶編碼基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:Ea3602在8和24 h的表達(dá)量逐漸降低,但與0 h相比無顯著差異(圖3);相反,Ea1236在8和24 h的表達(dá)量逐步提高,分別較0 h提高2.43和3.26倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此推測β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌的毒力因子,在侵染寄主植物過程中發(fā)揮重要作用,而內(nèi)切葡聚糖酶EAMY_3602則與梨火疫病菌侵染無明顯關(guān)聯(lián)。

    A:PhoA檢測體系的載體示意圖;B:信號肽3602SP和1236SP引導(dǎo)mphoA分泌圖2 利用phoA體系檢測EAMY_3602和EAMY_1236的信號肽Fig.2 The signal peptides of EAMY_3602 and EAMY_1236 were detected by phoA system

    注:**—與同組0 h相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖3 Ea3602和Ea1236基因在梨火疫病菌侵染過程中的表達(dá)分析Fig.3 Analysis on the expression of Ea3602 gene and Ea1236 gene in the process of infection of E. amylovora

    3 討論

    在細(xì)菌中,大約20%~30%的編碼蛋白定位于胞質(zhì)外,蛋白的胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)對于維持細(xì)菌生存至關(guān)重要[9,34]。Sec分泌途徑在細(xì)菌中廣泛存在,是蛋白胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)主要的跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)[35],包括毒力因子在內(nèi)的很多蛋白均通過Sec途徑分泌到胞質(zhì)外環(huán)境中[10-11]。關(guān)于梨火疫病的研究已有百余年歷史,目前已明確胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)能夠保護(hù)梨火疫病菌有效躲避植物防御系統(tǒng),以及在干旱條件下免受水分和營養(yǎng)損失[36-38];此外發(fā)現(xiàn)DspA/E、HrpN、Eop1和AvrRpt2EA等III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS)分泌蛋白對于病原菌入侵及其在寄主植物中定殖同樣具有重要作用[39-41]。最新研究顯示,梨火疫病菌可能利用Sec途徑分泌蛋白酶介導(dǎo)病原侵染[31]。本研究利用生物信息學(xué)分析結(jié)合PhoA檢測體系,從梨火疫病菌Sec分泌蛋白中篩選鑒定出2個(gè)纖維素酶:EAMY_3602和EAMY_1236。已有研究表明許多植物病原細(xì)菌和病原真菌分泌的纖維素酶是其完全毒力發(fā)揮所必需的[19-21];同時(shí),纖維素酶也是激發(fā)植物防御反應(yīng)的有效誘導(dǎo)物,例如,用纖維素酶處理甜椒葉片,能夠誘導(dǎo)水楊酸水平顯著增加[42]。

    纖維素酶根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和作用方式,可分為外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[43-44]。參照梨火疫病菌編碼蛋白的功能注釋[26],本研究篩選的兩個(gè)纖維素酶EAMY_3602和EAMY_1236分別為內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。關(guān)于病原菌內(nèi)切葡聚糖酶已有大量研究,如:水稻黃單胞菌(X.oryzaepv.oryzae)、菊歐文氏菌(E.chrysanthemi)、柑橘黃單胞菌亞種(X.citrisubsp.citri)的內(nèi)切葡聚糖酶均為其重要毒力因子,參與病原菌的致病過程[21,45-46]。但是,本研究發(fā)現(xiàn)梨火疫病菌在侵染幼梨時(shí),Ea3602的mRNA表達(dá)量沒有顯著變化,因而推測Sec分泌內(nèi)切葡聚糖酶EAMY_3602可能與梨火疫病菌侵染無密切關(guān)聯(lián)。與之相反,Ea1236基因在病原侵染過程中mRNA表達(dá)量顯著提高,暗示β-葡萄糖苷酶EAMY_1236可能是梨火疫病菌潛在的毒力因子。但根據(jù)早期報(bào)道,梨火疫病菌在致病過程中沒有造成寄主植物細(xì)胞壁多糖的降解[47],暗示纖維素酶沒有參與該病原對寄主的侵染;此外,另有文獻(xiàn)指出在梨火疫病菌中表達(dá)大腸桿菌β-葡萄糖苷酶,對其毒力沒有顯著影響[48]。因此,我們在后續(xù)研究中將制備Ea1236基因的敲除突變體,確證EAMY_1236是否參與病原侵染以及在不同時(shí)空維度的作用,以期揭示梨火疫病菌致病的新機(jī)制。

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