高毒力肺炎克雷伯菌分子致病機制研究進展*

張 穎，李 軼 綜述，郭 思,2△ 審校

1.河南大學人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院檢驗科,河南鄭州 450003;2.華中阜外醫(yī)院檢驗科,河南鄭州 450003

1882年，肺炎克雷伯菌(KP)首次從死于肺炎的患者的肺中被分離出來[1]。 KP屬于腸桿菌科，是人類胃腸道菌群的一部分。它們攜帶多種毒力基因，并且具有獲得抗菌藥物抗性基因的能力，同時可以引起局部和播散性感染[2],是臨床常見的條件致病菌之一。大多數(shù)“經(jīng)典”肺炎克雷伯菌(cKP)能夠引起肺炎、尿路感染、腹腔感染、血管內(nèi)裝置感染、手術部位感染、軟組織感染、菌血癥等，常發(fā)生于住院需長期護理或免疫功能低下的患者，一般常規(guī)用β-內(nèi)酰胺類和其他有效對抗腸桿菌科的抗菌藥物進行治療[3]。臨床變異的高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)在過去20年中逐漸出現(xiàn)[4]。與cKP不同，hvKP所致感染常發(fā)生在健康的流動性人群中，通常引起社區(qū)獲得性感染，并伴有遠處轉(zhuǎn)移或擴散，嚴重者可危及生命。除此之外，hvKP感染的肝膿腫患者通常無肝膽病史[5]。目前，尚無統(tǒng)一標準定義hvKP，對hvKP的鑒定大部分通過拉絲試驗，在瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落過夜后，用接種環(huán)輕觸菌落，若有黏液絲且拉絲長度>5 mm，即可初步判斷為hvKP。hvKP的高黏性特征與其毒力有密切的關系，因而被認為是鑒定hvKP的有效指標。但是也有研究發(fā)現(xiàn)不是所有的hvKP菌株都表現(xiàn)為高黏性特征[5]。控制細菌莢膜多糖(cps)合成的基因可在不同菌株間通過水平傳遞的方式轉(zhuǎn)移，使不具備hvKP特征的菌株也表現(xiàn)出高黏性特征，這使得hvKP與細菌菌落高黏性特征間的相關性大大降低。因此，不能僅憑高黏性特征和血清型鑒定hvKP，而應明確菌株的表型和基因型特性是否符合hvKP的特性以鑒定菌株的毒力[6]。本研究就hvKP的毒力相關因子及分子致病機制進行了綜述。

1 hvKP的毒力相關因子

hvKP的高毒力與多種毒力因子密切相關，例如鐵載體、莢膜血清型、菌毛等。其中cps的合成增加與攝取鐵能力的增強共同組成hvKP毒力增強的主要因素[7]。

1.1鐵載體 鐵是一種對細菌生長至關重要的元素，獲取鐵的能力對細菌的生長和復制尤為重要。這種特性在感染過程中起著至關重要的作用[1]。KP必須從宿主獲取鐵，以便在哺乳動物感染期間存活和繁殖。許多病原體(包括KP)獲取鐵的主要方法是通過鐵載體的分泌，鐵載體比宿主轉(zhuǎn)運蛋白對鐵有更高的親和力，可以從宿主鐵螯合蛋白中獲取鐵元素或從環(huán)境中清除鐵[8-9]。另外，鐵載體的分泌也誘導炎癥和細菌傳播。KP可分泌多種類型的鐵載體，包括氣桿菌素、腸桿菌素、沙門菌素和耶爾森桿菌素。不同鐵載體的產(chǎn)生可以使KP定植并傳播到宿主內(nèi)的不同位點，在加入人類腹水的培養(yǎng)基或貧鐵的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng) hvKP和cKP，通過鐵載體定量試驗(CAS檢測法)測得hvKP可分泌數(shù)量更多、活性更強的鐵載體，這可能是KP毒力增強的重要機制之一[7]。研究還發(fā)現(xiàn)hvKP菌株的鐵載體活性為cKP菌株的6～10倍[7]。腸桿菌素在cKP和hvKP菌株中幾乎無處不在，被認為是KP的主要鐵攝取系統(tǒng)，相比之下，耶爾森桿菌素、沙門菌素和氣桿菌素的表達水平在hvKP中比在cKP中高得多[8]。RUSSO等[10]通過使野生型hvKP(hvKP1)基因位點突變，發(fā)現(xiàn)無論是在體內(nèi)及體外培養(yǎng)都不能單獨合成沙門菌素、耶爾森桿菌素、腸桿菌素，都不能使hvKP的毒力減低，而不能合成氣桿菌素的菌株毒力會明顯下降，因此氣桿菌素被認為是hvKP最重要的鐵載體，也是其重要的毒力因子。目前氣桿菌素的水平在hvKP中明顯增多的機制尚不清楚，但已經(jīng)確定的是，在鐵缺乏的條件下，hvKP鐵載體總含量得以增加的主要原因是氣桿菌素的存在[11]。另外，耶爾森桿菌素的分泌和利用也與患者的呼吸道感染有關，hvKP強大的鐵攝取系統(tǒng)使得細菌在缺乏鐵的情況下也能保證足夠的鐵來源。

1.2cps

1.2.1莢膜 臨床資料表明，具有高黏性特征的KP菌株更易引起一些特殊的侵襲性感染，例如肝膿腫、腦膜炎、膿胸、眼內(nèi)炎等，高黏性特征在這些菌株引起感染的過程中可能發(fā)揮了重要作用[6]。hvKP的高黏液性和高毒力特征與其增厚的莢膜有關。莢膜是一種包裹細菌的細胞外多糖基質(zhì)，是細菌的一種特殊結構。莢膜的結構與細菌的黏附、抗血清殺菌、抗吞噬和遠處定植的特性密切相關[12]。hvKP菌落黏稠的性狀正是cps合成旺盛的直接表現(xiàn)。cps由位于染色體上的cps基因簇編碼,cps基因簇全長21～30 kb，包括16～25個基因。cps基因簇中wzi、wza、wzb、wzc、gnd、wca、cpsB、cpsG、galF與cps合成相關，wzy(orf4)、cpsB、cpsG與cps聚合相關，wza、wzc、orf5、orf6與裝配相關,wzi編碼莢膜黏附相關的表面蛋白[13]。有研究者用分離自患肝膿腫小鼠的KP制成一系列濃度梯度的菌液，注入小鼠體內(nèi)，以半數(shù)致死量(LD50)評估菌株的毒力，結果顯示K1型野生型菌株LD50(<10 CFU)遠小于不產(chǎn)莢膜的K1型突變株LD50(>1×106CFU)，以此證實了cps的毒力作用[14]。

1.2.2血清型 根據(jù)cps的不同，KP被分為82種血清型[15]，hvKP菌株由于擴增莢膜物質(zhì)的產(chǎn)生，產(chǎn)生更加堅固的莢膜，其中K1和K2血清型與細菌的高毒力密切相關，是導致臨床細菌性肝膿腫的主要致病菌。K1型常繼發(fā)于遠處轉(zhuǎn)移。最近有研究表明K1、K2、K5、K6、K20、K54、K57及新發(fā)現(xiàn)的 KN1血清型與hvKP有關[12]。LIU等[16]對北京朝陽醫(yī)院2008-2012年檢測出的hvKP進行PCR及多位點基因分析，發(fā)現(xiàn)hvKP莢膜分型中常見的是K1、K2、K20和K57，并且hvKP陽性患者更易發(fā)生社區(qū)獲得性感染，且多集中于K1及K2型。有研究對2013-2014年北京3家教學醫(yī)院肝膿腫病例進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)引起肝膿腫的hvKP以K1型為主(53.9%)，其次為K2型(32.2%)[13]。那么，為什么K1和K2血清型在hvKP中如此普遍？主要有以下幾個原因：(1)K1和K2菌株缺乏被宿主因子識別的特定甘露糖殘基重復序列，例如巨噬細胞上的甘露糖結合受體和肺分泌的表面活性蛋白A(SP-A)；(2)K1和K2菌株表面具有宿主特異性單糖唾液酸，可模擬宿主細胞，從而可逃避宿主免疫細胞；(3)與其他血清型菌株相比，K1和K2菌株可誘導嗜中性粒細胞釋放更小的活性氧物質(zhì)，從而可以更好地存活于人體組織中；(4)與具有其他K血清型的菌株相比，K1和K2菌株具有更多樣的O血清型，其可以幫助K1和K2菌株逃避宿主免疫系統(tǒng)。K1及K2型莢膜最初被認為是hvKP的主要毒力因子，也被定義為hvKP最初的主要特征。但是，并非所有的hvKP引起的社區(qū)獲得性肝膿腫都是K1及K2型，在非社區(qū)性獲得性肝膿腫的小鼠模型中也檢測出K1、K2型，并且表現(xiàn)出較低的毒性[10]。TAN等[17]對129株分離出的hvKP進行PCR測定，發(fā)現(xiàn)超過一半和肝膿腫有關的血清型不是K1及K2型。所以，hvKP的毒力強弱并非僅僅是K1、K2莢膜血清型分型導致的，可能與其毒力基因有關。

1.2.3高黏性表型 參與調(diào)控胞外cps合成的主要莢膜轉(zhuǎn)錄激活因子有RmpA及RmpA2。目前認為位于染色體上的c-rmpA基因和質(zhì)粒上的p-rmpA、p-rmpA2基因在hvKP中參與編碼RmpA、RmpA2[18]。

RmpA可激活莢膜產(chǎn)生，導致高黏液表型和毒力增加。在KPCG43中，p-rmpA和p-rmpA2均有助于增加莢膜產(chǎn)生，而在NTUH-K2044(ST23、K1血清型)中，第一個基因組測序的hvKP，只有p-rmpA促成莢膜基因表達的增加。因此，說明每種RmpA在超毒力中的作用也是十分必要的。最近，吳桂立[19]在臨沂地區(qū)hvKP的分子致病機制研究中發(fā)現(xiàn)，69株KP中具有高黏液表型的hvKP為37株，其中收集的 hvKP 菌株全部表達RmpA，因此，RmpA可以作為實驗室診斷hvKP的輔助參考指標。此外，有研究表明，RmpA以RcsB依賴性方式激活cps表達，并且其DNA結合基因序列是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用所必需的[20]。

黏液相關基因A(magA)于2004年被發(fā)現(xiàn)，magA存在于Kl型KP的cps體生物合成區(qū)內(nèi)，被認為與細菌高黏性、血清抵抗及細胞吞噬抗性有關，作為KP cps聚合酶wzy負責K抗原的合成，現(xiàn)將magA重命名為wzykDk。臺灣的一項研究顯示，83%來自化膿性肝膿腫患者的KP菌株為magA陽性，從其他侵襲性感染患者中分離的菌株中只有3%為magA陽性[15]。但是，最近有研究發(fā)現(xiàn)，許多高黏性KP菌株并未檢測出magA基因，一些表達magA的菌株也并未表現(xiàn)出高黏性特征，表明magA基因與高黏性特征兩者之間可能并沒有特定的聯(lián)系[6]。在對77株已明確血清型的KP菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，magA僅存在于K1血清型的菌株中，因此，認為magA基因是編碼K1血清型菌株cps的主要基因，而非特定的毒力基因，即magA基因是一個編碼KP的莢膜血清型而非高黏性特征的cps基因[6]，在K1血清型KP中是重要的毒力因子，與其致病性有很大的聯(lián)系。

1.3菌毛 細菌黏附于宿主細胞表面是其進展至感染的關鍵步驟之一，在KP中，這通常通過菌毛來實現(xiàn)[3]。目前，已知兩種類型的菌毛存在于KP中，即1型和3型菌毛。雖然已知3型菌毛能與氣管上皮細胞、腎小管細胞等不同人類細胞結合，但1型菌毛似乎更具有特異性。另外，KP菌株產(chǎn)生生物膜的能力增強導致KP對宿主防御因子和抗微生物劑的抗性增加，并且生物膜越來越多地被認為是重要的毒力因子。影響生物膜形成的因素有很多，如莢膜、菌毛、數(shù)量感知系統(tǒng)等，其中菌毛在生物膜的形成過程中起到至關重要的作用[21]。而1型和3型菌毛也與KP中的生物膜形成有關(3型菌毛比1型菌毛作用更強)[22]。hvKP比cKP產(chǎn)生更多的生物膜，這可能也是其毒力增強的原因之一。

1.4序列類型 序列分型是用于菌株分類的分子流行病學方法，并且已經(jīng)用于KP的分型篩選[1]。hvKP菌株具有特定的MLST序列型別，如ST23與Kl莢膜血清型和肝膿腫密切相關，另外，ST57與K1型相關，ST86、ST375、ST380與K2型相關。常見的cKP序列分型為ST11、ST15、ST65和ST258，另外，K1/ST23更可能含有與高黏液表型和鐵攝取相關的毒力基因，與這些毒力基因共同促成hvKP的發(fā)病機制。與K1血清型相比，K2和其他血清型在ST方面遺傳多樣性差異更大，并且獲得毒力基因(kfu、irp、iuc、iro、rmpA)的可能性較小[2]。雖然hvKP的序列分型與其高毒力及致病性沒有直接的關系，但是對可能引起感染流行的hvKP進行序列分型有助于早期干預[23]。

2 hvKP的定植與感染

hvKP的定植是獲得內(nèi)源性感染的第一步，但是hvKP定植感染發(fā)病率及感染機制并不明確。hvKP在胃腸道、口咽、皮膚均可定植，但是胃腸道是定植的主要部位。細菌進入到腸道以外的組織或器官以繼續(xù)生長是整個感染的重要步驟，cKP和其他腸桿菌科感染的途徑包括從會陰部進入膀胱，破壞腸道使細菌進入腹膜腔，口咽部定植進入呼吸道，以及破壞皮膚屏障等。雖然hvKP進入機體的途徑并不明確，但是可以明確的是hvKP感染通常發(fā)生在宿主抵抗力無明顯缺陷的患者中。而且，hvKP進入宿主體內(nèi)并不一定會引起感染，細菌還需要應對宿主的抵抗力并在宿主體內(nèi)存活。研究表明hvKP菌株的存活能力明顯高于cKP菌株[24]。hvKP可以導致化膿性肝膿腫、脾膿腫、自發(fā)性細菌性腹膜炎、肺炎、眼內(nèi)炎、腦膜炎、尿路感染等。另外，糖尿病、惡性腫瘤、肺炎、腎臟疾病被認為是hvKP感染的高危因素。此外，hvKP感染導致的化膿性肝膿腫通常發(fā)生在無肝膽病史的人群中，定植在腸道的細菌通過侵犯腸黏膜進入門靜脈，繼而到達肝臟引起感染。通過對hvKP感染的小鼠模型的研究已經(jīng)證實hvKP可以穿過腸黏膜屏障導致肝膿腫。此外,吞噬了hvKP的中性粒細胞通過血液循環(huán)可將hvKP帶至機體的多個部位,導致皮下組織、肺、肝形成膿腫[5]。另外，hvKP感染存在一定的區(qū)域易感性，在亞洲人群中高發(fā)，這可能與宿主基因易感性或不同地域病原體暴露水平不同有關。

3 小 結

目前對hvKP的研究有限，鐵載體、莢膜血清型、高黏液表型、菌毛等被認為是hvKP的高毒力因子，并與其致病能力有關。但目前對其分子致病機制尚無法完全闡明，hvKP進入機體的途徑及發(fā)生轉(zhuǎn)移性播散的機制仍需要進一步研究，轉(zhuǎn)移性感染為何易發(fā)生于糖尿病患者，亞裔群體中hvKP為何具有較高的腸道攜帶率，其與免疫系統(tǒng)是如何相互作用，這些問題都亟待解決。但是，目前國內(nèi)對hvKP的研究還主要集中于hvKP的耐藥性。臨床工作者必須提高對hvKP的認識，深入研究hvKP的致病機制對于正確認識hvKP所致感染,降低hvKP的危害具有重要意義[25]。