枯草芽孢桿菌MB8兒茶酚型鐵載體的合成與結構分析

張茜茜，朱慧明，楊肖靜，黃志偉 ，龔夢馨，張志強 ，牛津徽，楊洪江

(1.天津科技大學生物工程學院 工業(yè)微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029)

【研究意義】細菌和真菌產生的鐵載體，是一類對Fe3+具有較高親和力的小分子金屬離子螯合物(500～1500 daltons)，主要功能是為細胞提供鐵營養(yǎng)成分[1]。鐵載體根據官能團的不同主要分為氧肟酸型、兒茶酚型和檸檬酸型3類[2]；而根據鐵載體的結構進行分類，主要分為線性結構和環(huán)狀結構。盡管鐵載體之間存在很多的差異，但多數借助帶負電荷的氧原子與Fe3+結合，6個配體與1個Fe3+形成最常見的六面體或八面體結構[3]。隨著研究的深入，大量鐵載體的相似物被發(fā)現(xiàn)，如與ferrioxamines結構相似的鐵載體就高達20種[4]。這些類似物的不同之處在于側鏈上的短肽，這些多肽為Fe3+結合提供了最適的結合位點，同時還保護鐵載體免受水解酶的破壞作用。【前人研究進展】鐵載體一方面為生物提供鐵營養(yǎng)成分，維持微生物的正常生長；另一方面，某些鐵載體不僅能螯合Fe3+，還能與Al3+、Co2+、Pb2+和Cu2+等金屬離子結合[5]。鐵載體(desferrioxamine, DFOB)在高pH值下，與鈷離子的螯合能力大于鐵離子，在對礦山廢棄物或者金屬污染的土壤進行生物修復時，可以使用鐵載體清理重金屬離子，對于環(huán)境的生物修復具有重要應用價值[6]。東方擬無枝酸菌Amycolatopsisorientalis產生的鐵載體乙二胺二琥珀酸(ethylene diaMino-disuccinic acid, EDDS)以及根瘤菌Rhizobiummeliloti產生的鐵載體rhizobactin，被認為是天然的生物可降解的APCAs(aminopolycarboxylic chelating agents)型螯合劑，能夠替代合成螯合劑，與不同金屬形成絡合物，同時不污染環(huán)境，是一種經濟且環(huán)境友好的技術[7]?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗室分離了一株產鐵載體的枯草芽孢桿菌MB8[8]，本研究擬對MB8合成鐵載體的培養(yǎng)條件、鐵載體的類型及分子結構、鐵載體的抗氧化作用以及促進不溶性針鐵礦溶解的功能等方面進行分析?！緮M解決的關鍵問題】旨為枯草芽孢桿菌MB8的可能應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌B.subtilisMB8分離自雞糞樣品中，具有合成鐵載體的能力[8]。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基主要用于細菌的常規(guī)培養(yǎng)，MKB(Modified King B)培養(yǎng)基主要用于對常見致病菌的培養(yǎng)，察氏培養(yǎng)基(Czapek Dox Medium)主要用于霉菌的培養(yǎng)。AM(Arginine Medium)培養(yǎng)基[9]主要用于培養(yǎng)菌株產生鐵載體，成分為K2SO41 g/L、CH3COONH43 g/L、MgSO40.8 g/L、ZnSO40.0086 g/L、MnSO40.113×10-3g/L、葡萄糖20 g/L、精氨酸1.5 g/L、Na2HPO43 g/L，調pH至7.0。

1.1.3 溶液 CAS(Chrome Azurol S)溶液[10]主要用于檢測鐵載體，成分為鉻天青S 1.21 g/L、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, HDTMA)1.82 g/L、FeCl3(溶于10 mmol/L HCl)0.27 g/L、無水哌嗪30.24 g/L，調pH至5.6。Arnow試劑主要用于檢測兒茶酚型鐵載體，成分為0.5 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、10 g鉬酸鈉和10 g亞硝酸鈉，溶解于部分去離子水中，待完全溶解后體積補至100 mL[11]。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液，含有400 μmol/L DPPH，溶于80 %的無水甲醇。

1.2 試驗方法

1.2.1 正交設計 為了確定最佳鐵載體產生條件，選取甘油、精氨酸、接種量這3個因素，以鐵載體產量SU為指標，設計正交實驗[12]，實驗因素水平見表1。

(1)

式中，Ar是未接種的培養(yǎng)基與等體積CAS混合后的OD680，As是菌株上清與等體積CAS混合后的OD680。

1.2.2 金屬離子對鐵載體產量的研究 2,3-二羥基苯甲酸標準曲線的繪制。為了定量分析菌株MB8產生的兒茶酚型鐵載體的含量，分別配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 g/L的2,3-二羥基苯甲酸(2,3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)標準溶液，Arnow試劑檢測，以OD510的吸光度值為縱坐標，以DHBA的濃度為橫坐標，繪制DHBA標準曲線。

Fe3+對菌株鐵載體產量的影響。在培養(yǎng)基中添加Fe3+，使Fe3+的終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0 μmol/L，36 h后測定菌株的生物量OD600和鐵載體產量，同時取1 mL菌液梯度稀釋涂板計數。

Al3+對菌株鐵載體產量的影響。為了比較鐵載體對Fe3+和Al3+的螯合能力，將常規(guī)的CAS溶液中的Fe3+用等體積等濃度的Al3+替代，然后取1 mL菌株MB8的無細胞上清液與2種CAS溶液混合，室溫下靜置1 h后測定OD680，以培養(yǎng)基為陰性對照；在培養(yǎng)基中添加Al3+，使其Al3+的終濃度分別為0、20、50和100 μmol/L，36 h后測定菌株的生物量OD600和鐵載體產量，同時取1 mL菌液梯度稀釋涂板計數。

Cu2+對鐵載體產量的研究。在培養(yǎng)基分別添加終濃度為0、20、50和100 μmol/L的Cu2+，36 h后測定菌株的生物量OD600和鐵載體產量，同時取1 mL菌液梯度稀釋涂板計數。

1.2.3 鐵載體對不溶性針鐵礦的溶解研究 不溶性針鐵礦(goethite)的制備。將180 mL 氫氧化鉀(5 mol/L)加入到100 mL硝酸鐵(1 mol/L)溶液中，迅速加入去離子水至體積為2 L，70 ℃下加熱60 h，待冷卻至室溫后去離子水洗滌至上清pH值為中性，真空冷凍干燥12 h后得到土黃色粉末狀物質，使用將其前加入到三角瓶中，121 ℃滅菌20 min[13]。

表1 正交實驗設計各因素及水平Table 1 Orthogonal experimental design of various factors and levels

鐵載體對不溶性針鐵礦的溶解利用。菌株MB8在終濃度為0和100 μmol/L Fe3+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，發(fā)酵液經離心過濾后，在每個已分裝有3 mg自制無菌針鐵礦(goethite)的三角瓶中加入30 mL不同鐵載體含量的無細胞濾液，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔12 h取出1瓶，10 000 r/min離心5 min除去不溶的針鐵礦，-80 ℃下預凍24 h，真空冷凍干燥12 h，加入15 mL純凈水，充分溶解后，利用原子吸收分光光度法測定溶液中鐵的含量[14]。

1.2.4 鐵載體結構的初步鑒定 鐵載體的溶劑萃取。10 000 r/min離心菌株MB8發(fā)酵液10 min，10 kD截留量的聚砜中空纖維柱超濾，濾液用6 mol/L HCl調pH值為2.0，用1/2體積的乙酸乙酯萃取3次，棄水相保留有機相，0.1個真空度30 ℃旋蒸，沉淀溶于無水甲醇，0.22 μm有機濾膜過濾后4 ℃下保存[15]，為鐵載體粗提液。

液質聯(lián)用對鐵載體結構進行初步分析。①全波長掃描 對含有鐵載體的溶液進行全波長掃描，確定菌株MB8鐵載體的吸收波長。②HPLC-ESI-MS。將上述得到的菌株MB8鐵載體粗提液進行高效液相色譜檢測，條件設置分別為：色譜柱類型：Phenomenex Luna C18(5 μm)；流動相：5 %乙腈(0.1 %甲酸)-100 %乙腈(0.1 %甲酸)；柱溫：25 ℃；離子源：ESI；離子極性：負離子；掃描范圍：100 ℃1 000 m/z。③UPLC-ESI-MS/MS。利用Waters UPLC-Quattro Premier XE三重四級桿液質聯(lián)用儀對菌株MB8產生的兒茶酚型鐵載體進行進一步的分析，該儀器配有Waters ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm，2.1100 mm柱子)，一級質譜的掃描范圍是100～1000 m/z，二級質譜的掃描范圍是50～950 m/z，二級質譜碰撞能量為10、20、30和40 V。

1.2.5 鐵載體抗氧化作用的研究 鐵載體具有的抗氧化能力通過對DPPH自由基清除能力來表示，對DPPH的清除能力越大，說明兒茶酚型鐵載體的抗氧化能力越強。菌株分別在含有0 和100 μmol/L Fe3+濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，鐵載體產量SU分別為91.99 %和1.01 %，發(fā)酵液經酸化和乙酸乙酯萃取處理，得到的溶液旋蒸至干，甲醇溶解后，稀釋1000倍后取不同體積(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL)于試管中，補加甲醇至2 mL，然后再分別添加2 mL DPPH溶液，避光室溫下反應30 min后測定517 nm處的吸光度值[16]。

(2)

式中，A1：樣品和DPPH混合30 min后的OD517；A2：甲醇和DPPH混合30 min后的OD517；A3：樣品和甲醇混合30 min后的OD517。

2 結果與分析

2.1 菌株MB8分泌鐵載體條件的優(yōu)化

選取甘油、精氨酸、接種量為單因素，選用L9(34)正交表安排實驗。根據表2的極差分析結果可以看出，對MB8鐵載體產量影響的主次順序是甘油>接種量>精氨酸；從表3的正交結果方差分析顯示，區(qū)間組F=2.56，概率P= 0.1480 >α=0.05，說明區(qū)間組差異不顯著，即可不考慮因素之間的交互作用；A(甘油)因素F= 19.32，概率P= 0.0009 <α =0.01說明甘油濃度對鐵載體產量的影響極為顯著；B(精氨酸濃度)因素F= 0.99，概率P=0.4129 >α =0.05，說明B精氨酸濃度的改變對菌株鐵載體產量影響不顯著；C因素F= 4.37，概率P= 0.0522>α =0.01，略大于α =0.05，說明接種量對菌株鐵載體產量影響微顯著。綜上可得最優(yōu)的培養(yǎng)條件為甘油濃度4 %(mL/L)，精氨酸濃度1.5 g/L，其余成分保持不變，接種量為7 %。

表2 L9(34) 鐵載體產量正交實驗結果Table 2 Orthogonal experiment results of siderophore-production

表3 正交實驗方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment

2.2 金屬離子對鐵載體產量的影響

為了定量分析兒茶酚型鐵載體的含量，按照Arnow方法檢測不同濃度的2,3-二羥基苯甲酸(2, 3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)標準溶液，獲得DHBA的標準曲線，如圖1所示。根據上述求得的方程式，經過培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數的優(yōu)化，MB8產生的兒茶酚型鐵載體量OD510= 1.991，相當于DHBA標品的濃度為0.117 g/L。

Al3+是一種常見的三價金屬元素，與Fe3+具有相似的離子半徑，當用等體積等濃度的Al3+代替常規(guī)CAS溶液中的Fe3+，全波長掃描藍色CAS-Al3+-CTAB絡合物，發(fā)現(xiàn)CAS-Al3+-CTAB絡合物的特異吸收波長依然在680 nm處。取等體積上清與2種CAS溶液混合，室溫下靜置反應1 h，發(fā)現(xiàn)混合液中CAS-Al3+-CTAB濃度大于CAS-Fe3+-CTAB，也就是說MB8產生的鐵載體在相同濃度和相同時間內，從CAS-Al3+-CTAB中競爭螯合Al3+的能力要小于從CAS-Fe3+-CTAB中競爭螯合Fe3+的能力。

圖1 2,3-二羥基苯甲酸標準曲線Fig.1 Standard curve of 2,3-dihydroxy-benzoic acid

如圖2(A)所示，當菌株MB8在含有不同濃度的Al3+培養(yǎng)基中生長時，菌株生物量無顯著差異，但每個細胞產生的鐵載體產量 顯著增加，與對照(0 μmol/L Al3+)相比，Al3+濃度分別為20、50和100 μmol/L，兒茶酚型鐵載體產量相應提高了24.66 %、34.15 %和34.40 %。針對這種現(xiàn)象最可能的解釋就是當Al3+與鐵載體結合后，生物不能獲得足夠的鐵營養(yǎng)滿足自身的生長，被迫產生更多的鐵載體來獲得鐵元素。

除此之外，菌株的鐵載體產量還受到二價金屬離子的影響。如圖2(B)所示，適量的Cu2+對MB8的生長有促進作用，當濃度增加到100 μmol/L時，菌株生物量出現(xiàn)明顯下降，但每個細胞的鐵載體產量卻沒有因Cu2+濃度的變化受到影響，說明在一定的濃度范圍內，Cu2+濃度的變化對鐵載體產量無顯著影響。

2.3 鐵載體促進不溶性針鐵礦的溶解

在低鐵載體含量下，不溶性針鐵礦24、36和60 h的溶解度分別是0.019、0.024和0.035 μg/mL，溶解速率分別為0.002、0.002、0.003 μg/(mL·h)；高鐵載體含量下，不溶性針鐵礦在24、36、48、60、72和84 h的溶解度分別是0.028、0.028、0.111、0.139、0.167和0.223 μg/mL，此時的溶解速率分別是0.002、0.002、0.009、0.012、0.014和0.019 μg/(mL·h)，鐵載體的作用使得不溶性針鐵礦的溶解速率提高了約6倍。

圖2 金屬離子對菌株MB8鐵載體產量的影響Fig.2 Effect of metal ion on siderophore-production of MB8 strain

2.4 色譜分析鐵載體結構

分別對標品2,3-羥基苯甲酸(2,3-DHBA)、乙酸乙酯萃取后的水相樣品和有機相樣品，進行全波長掃描，根據掃描結果選擇245 和315 nm作為吸收波長。初步分離后的發(fā)酵液經過高壓液相分離，在色譜圖上出現(xiàn)多個峰，其中保留時間為13.320 min的峰(圖3)與標品2,3-DHBA的保留時間為13.420 min相近，所以，鐵載體粗提液中可能含有DHBA。

2.5 ESI離子源負離子模式質譜儀分析鐵載體的結構

將高壓液相制備的物質依次加入ESI離子源負離子模式質譜儀中，如圖4所示，液相中保留時間11.48，13.18、13.30和14.55 min對應的質荷比(m/z)為311、605、153和881，分別與[(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[(DHBA-Gly-Thr)2-H]-、[DHBA-H]-和[(DHBA-Gly-Thr)3-H]-一致。

2.6 UPLC-ESI-MS/MS質譜儀分析鐵載體結構

為了確認菌株MB8合成鐵載體的結構，選取質荷比為881 m/z的離子進入UPLC-ESI-MS/MS質譜儀，如圖5所示，m/z為881的離子(M)被進一步離子化，出現(xiàn)的碎片質荷比主要有587、293和192，分別與[M-(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[M-(DHBA-Gly-Thr)2-H]-和[DHBA+Gly-H]-對應，其中m/z為249是去碳酸基的[DHBA-Gly-Thr-H]-。

綜合以上結果，初步推斷菌株MB8產生的兒茶酚型鐵載體可能與已知的Bacillibactin相似，分子量為882，以中間代謝產物DHBA為前體物質，通過肽鍵與甘氨酸Gly和蘇氨酸Thr結合形成單體，然后單體聚集在一起形成二體或環(huán)狀三體[17]。

2.7 鐵載體的抗氧化作用

Maud等人研究表明沙門氏菌能分泌的兒茶酚型鐵載體，且該物質能幫助沙門氏菌應對某些氧化壓力[18]。為了確定菌株MB8產生的兒茶酚型鐵載體是否具有抗氧化能力，利用對DPPH自由基的清除能力來表示其抗氧化能力。如圖6所示，將鐵載體產量SU分別為91.99 %和1.01 %的粗提液，分別稀釋1000倍后取不同體積后與DPPH溶液避光混合，其中鐵載體含量SU為91.99 %的粗提液對DPPH自由的清除能力隨著體積的增加逐漸增大，而鐵載體含量SU為1.01 %的粗提液對DPPH的清除能力幾乎沒有變化。

A：標品2,3-二羥基苯甲酸；B：菌株MB8的鐵載體粗提液圖3 高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram

A：溶液1在HPLC-ESI-MS的負離子模式下的總離子流圖；箭頭：指向的是某一質荷比的選擇離子流圖；B：相應保留時間下物質的質譜圖圖4 溶液中不同保留時間下的質譜圖Fig.4 Mass spectra of the peak with different retention time of sample

3 討 論

自然界中，細菌通過合成分泌鐵載體獲取所需的鐵元素用于生長，并在各種微生物生態(tài)系統(tǒng)中獲得競爭優(yōu)勢。芽孢桿菌是重要的革蘭氏陽性菌，目前已經從不同環(huán)境中分離出多種能夠合成鐵載體的菌株。例如從文冠果植株根系瘤狀物分離獲得了能夠產鐵載體的多株內生細菌，分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)[19]；從黑麥草根際土壤中分離到1株產鐵載體巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumLY02，該菌株具有較強的耐鎘能力[20]；從花生根際分離篩選出產鐵載體芽孢桿菌HSGJ1，對鎳離子具有較強耐受性，能夠有效促進花生生長，并降低花生根系的鎳離子含量[21]；從海南辣椒的根際土壤中分離了產鐵載體的枯草芽孢桿菌B.subtilisCAS15，能夠有效地促進植株的生長[22]；從煉鐵廠土壤中分離了芽孢桿菌Bacillussp. SD12，具有較強的抗真菌活性[23]。短小芽孢桿菌BacilluspumilusToIrMA-KC806242能夠合成鐵載體，可以作為潛在生物防控因子，抑制番茄枯萎病[24]；從CoffeaarabicaL.根際土壤中分離了芽孢桿菌BT42，能夠鐵載體，抑制CoffeaarabicaL.的病原菌[25]。

芽孢桿菌合成的鐵載體具有多樣性?？莶菅挎邨U菌B.subtilisCAS15能夠合成鐵載體catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin[22]。芽孢桿菌BacillusSp. SD12能夠合成異羥肟酸類型的鐵載體[23]。蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisATCC 33679合成鐵載體bacillibactin，炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisSterne strains和蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusATCC 14579能夠分泌2種兒茶酚鐵載體、1種攜帶3,4-dihydroxybenzoyl基團的鐵載體petrobactin和攜帶2,3-dihydroxybenzoyl的鐵載體bacillibactin[26]。淀粉液化芽孢桿菌BacilluslicheniformisVK21合成一種兒茶酚胺類型鐵載體(Catecholic Siderophore)，經過氨基酸分析與核磁共振分析，確定其結構為2,3-dihydroxybenzoyl-glycyl-threonine[27]。

色譜圖顯示：由上至下分別m/z=881(RT=10.93)在不同碰撞能量下的二級質譜圖，由上至下碰撞能量依次為10、20、30、40V)圖5 UPLC-ESI-MS/MS質譜圖Fig.5 UPLC-ESI-MS/MS spectra

圖6 鐵載體對DPPH自由基的清除率Fig.6 Eliminating ratio of hydroxyl radical by siderophore

鐵載體的發(fā)酵一般是在低鐵培養(yǎng)基中完成。在培養(yǎng)基中加入一定濃度的錳離子，能夠顯著提高淀粉液化芽孢桿菌BacilluslicheniformisVK21分泌鐵載體的水平[27]。巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumATCC 19213合成鐵載體于葡萄糖是否存在無關，甘油作為碳源能夠顯著提高鐵載體的水平，甘露糖具有相反作用，靜止培養(yǎng)鐵載體水平顯著低于震蕩培養(yǎng)[28]。本研究中，適當濃度的甘油、精氨酸、鋁離子和銅離子，能夠促進鐵載體的分泌。

4 結 論

本文對菌株B.subtilisMB8分泌的鐵載體進行了研究，發(fā)現(xiàn)在鐵脅迫條件下分泌的鐵載體水平較高，分泌的鐵載體具有良好的抑菌作用、清除DPPH自由基的抗氧化能力和加速不溶性針鐵礦溶解的能力。此外，利用UPLC-ESI-MS/MS對B.subtilisMB8產生的鐵載體進行分析，初步推斷鐵載體結構含有2,3-二羥基苯甲酸、甘氨酸和蘇氨酸，與已知鐵載體Bacillibactin具有相似結構。B.subtilis菌株MB8能夠產生芽孢，對逆環(huán)境有一定的耐受能力，更易于保存和運輸，在多種領域可能具有較好的應用前景。