現(xiàn)代月季6個品種花粉超低溫保存研究

李澤迪，杜 瑩，姜雪茹，魯月秀，任瑞芬，張逸璇，劉 燕*

(1.北京林業(yè)大學園林學院,花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室,國家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；2.北京植物園，北京 100093)

【研究意義】雜交育種是月季培育新品種的重要手段[1]。已知的2萬多個現(xiàn)代月季栽培品種中，有80 %是通過品種間反復雜交獲得的[2]。因此花粉成為培育新品種的關(guān)鍵因子之一。在自然狀態(tài)下，月季花粉壽命較短，已有研究表明常溫下許多品種不超過5 d，在0～5 ℃恒溫冰箱冷藏的花粉活力可以保持10 d[3]。因此月季花粉的長期保存研究有重要的意義，不僅可以解決月季雜交育種中花期不遇和地域障礙等問題，也是種質(zhì)資源保存的一條途徑[4]。但是月季花粉保存研究鮮見報道。【前人研究進展】超低溫保存是近幾十年發(fā)展起來的新技術(shù)，是實現(xiàn)花粉長期保存的有效途徑[5]。目前已在果樹[6]、農(nóng)作物[7-8]和多種園林植物花粉保存中廣泛應用[9-10]，花粉貯存壽命可達10年以上仍然有授粉結(jié)實能力[11]。薔薇屬4種植物花粉不同貯存方法研究顯示，雖然超低溫保存沒有成功，但它仍然是徹底解決多數(shù)花粉貯存的有效途徑，該技術(shù)在月季花粉保存中需要進一步研究[12]?！颈狙芯壳腥朦c】花粉超低溫保存成敗評價受多種因素影響，與花粉基因型、含水量、萌發(fā)培養(yǎng)等密切相關(guān)。本試驗以6個現(xiàn)代月季品種花粉為試材，研究不同濃度蔗糖、硼酸組合對花粉萌發(fā)的影響，篩選適合花粉離體萌發(fā)的適宜培養(yǎng)液；采用掃描電子顯微鏡觀察6個品種花粉形態(tài)；在此基礎上對采自不同季節(jié)的花粉進行超低溫保存?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在探索超低溫保存技術(shù)應用于月季花粉保存的可行性以及花粉形態(tài)、采收季節(jié)、含水量對花粉超低溫保存效果的影響，為月季花粉長期保存提供新的技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6個現(xiàn)代月季品種為 ‘金鳳凰’、‘金瑪麗’、‘倫特娜’、‘仙境’、‘希望’、‘雨果’。其花粉于2017年10月(秋季，氣溫為8～19 ℃)和2018年5月(春季，氣溫為17～29 ℃)采自北京植物園月季圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉采集 于晴朗無風的上午(9:00-12:00)，采收次日即將開放的花蕾，裝入硫酸紙袋，帶回實驗室后立即用干凈的鑷子將花藥從花蕾中取出，均勻平鋪在硫酸紙上，待24 h后花藥自然開裂，花粉散出，過細孔篩收集花粉備用。

1.2.2 花粉含水量測定 烘箱干燥法測定花粉含水量。取干燥并置于干燥器中的稱量瓶，測定重量記為a；取0.05 g的新鮮花粉置于稱量瓶中，測定總重記為b；打開瓶蓋放入烘箱中保持103 ℃烘干4 h后封蓋放入干燥器中冷卻；稱量花粉與稱量瓶的總重，反復烘干，冷卻后稱重，直至恒重，記為c。以鮮重為基數(shù)計算花粉含水量，花粉自然含水量=(b-c)/(b-a)×100 %。每個處理重復3次，取均值。

1.2.3 花粉離體萌發(fā) 采用懸滴法進行花粉離體萌發(fā)。在蓋玻片上滴適量培養(yǎng)液，將花粉均勻置于液滴上，翻轉(zhuǎn)蓋玻片放在凹槽載玻片上，將凹槽載玻片放置在鋪有吸滿水脫脂棉的培養(yǎng)皿上，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后于顯微鏡下統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)?；ǚ酃荛L度超過花粉粒直徑的2倍記為花粉萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100 %。每個處理設4個重復，每個重復隨機選取3個視野進行統(tǒng)計，取均值。

1.2.4 花粉離體萌發(fā)適宜培養(yǎng)液篩選 采用兩因素全面試驗設計。蔗糖濃度設置0 %、5 %、10 %、15 %、20 %(w/v)5個水平，硼酸濃度設置0 %、0.01 %、0.05 %、0.10 %(w/v)4個水平，共20個不同配方，每個配方設4次重復，進行花粉懸滴培養(yǎng)，根據(jù)花粉萌發(fā)率篩選最適宜培養(yǎng)基。

1.2.5 花粉超低溫保存 取0.1 g花粉，將花粉用鋁箔紙包好后裝入2 mL凍存管，直接投入液氮中保存；1月后檢測時取出凍存管，立即于自來水沖洗化凍3 min，再于25 ℃水中化凍20 min，然后進行花粉萌發(fā)率測定。

1.2.6 花粉形態(tài)觀察 取少許花粉均勻撣落在粘有電容膠的樣品臺上，真空狀態(tài)下在離子濺射儀中噴金，將處理好的樣品置于Quanta 200環(huán)境掃描電鏡下觀察，在合適比例下觀察花粉的極面觀、赤道觀形狀及花粉外壁紋飾并拍照。隨機選取20?；ǚ蹨y量花粉極軸長、赤道軸長、條脊寬、條脊間距以及萌發(fā)溝等相關(guān)數(shù)據(jù)，取均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Excel進行整理，采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基篩選

采用懸滴法將秋季采收的6個品種的花粉在不同蔗糖和硼酸組成的培養(yǎng)液中萌發(fā)，不同培養(yǎng)基、不同品種的花粉萌發(fā)率從0～24.3 %不等(表1)。蔗糖和硼酸濃度明顯影響花粉萌發(fā)。6個品種最高和次高萌發(fā)率都分別出現(xiàn)在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸和10 %蔗糖 + 0.05 %硼酸，與其他濃度配方相比花粉萌發(fā)率差異顯著。結(jié)果表明，此濃度范圍內(nèi)的蔗糖和硼酸營養(yǎng)液配比，比較適宜這些月季品種花粉萌發(fā)。‘金鳳凰’和‘雨果’在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸培養(yǎng)基中萌發(fā)率顯著高于10 %蔗糖 + 0.05 %硼酸，但其他4個品種，這2種培養(yǎng)液萌發(fā)結(jié)果差異不顯著。

表1 6個月季品種花粉在不同濃度蔗糖和硼酸組合培養(yǎng)液中的萌發(fā)率Table 1 Germination rates of 6 rose cultivars in different concentrations of sucrose and boric acid combination liquid culture

注：表中萌發(fā)率數(shù)據(jù)表示為4個重復的平均值±標準誤，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：The data of germination rate in the table showed that there were the mean of four replicates ± standard error, and different letters within same column indicate significant difference atP<0.05.

雖然不同品種在不同培養(yǎng)液中萌發(fā)率不同，但是有較高一致性，6個品種的花粉均在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸萌發(fā)率最高，因此，適合用做檢測這幾個月季品種花粉的生活力。

2.2 6個品種花粉自然含水量

用烘干法測定室內(nèi)自然散粉的花粉含水量，6個品種、不同季節(jié)花粉含水量測定結(jié)果見表2。

春季采收的花粉含水量為9.6 %～11.9 %；秋季采收的花粉含水量為9.2 %～11.5 %。同一品種不同季節(jié)花粉含水量變化因品種而異，‘金瑪麗’、‘希望’、‘雨果’和‘倫特娜’4個品種春、秋兩季采收的花粉含水量沒有顯著差異；而‘仙境’和‘金鳳凰’兩季花粉含水量顯著不同，但含水量變化值相差不大，春季采收的‘仙境’花粉含水量高于秋季2.4 %，而‘金鳳凰’低于秋季1.6 %。

2.3 6個月季品種花粉超低溫保存結(jié)果

由表3顯示，春、秋季采收的花粉經(jīng)過液氮保存后均能正常萌發(fā)；不同品種、不同季節(jié)采收的花粉液氮保存1個月后萌發(fā)率為10.36 %～21.28 %，為新鮮花粉的59.3 %到133.9 %不等，表明這6個月季品種的花粉可以采用超低溫方法保存。

不同品種新鮮花粉萌發(fā)率不同，春季采收的花粉從8.91 %～27.07 %不等，秋季采收的花粉從9.95 %～24.32 %不等；其中‘金鳳凰’、‘仙境’、‘倫特娜’3個品種春、秋季新鮮花粉萌發(fā)率顯著不同，春季花粉萌發(fā)率分別高于秋季花粉2.75 %、6.67 %和7.98 %；另外3個品種春、秋季新鮮花粉萌發(fā)率無顯著差異。結(jié)果表明，整體看春季新鮮花粉萌發(fā)率高于秋季。從春、秋采收的花粉超低溫保存后萌發(fā)率看，3個品種春季花粉顯著高于秋季，3個品種差異不顯著，整體看，春季花粉超低溫保存后萌發(fā)率較高。

表2 6個月季品種的自然含水量Table 2 Natural moisture content of 6 rose cultivars

注：表中數(shù)據(jù)表示3個重復的平均值±標準差，同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：The data of moisture content in the table showed that there were the mean of three replicates ± standard deviation, and different letters within same row indicate significant difference atP<0.05.

表3 超低溫保存前后6個月季品種花粉萌發(fā)率Table 3 Pollen germination rate of 6 rose cultivars pollens before and after cryopreservation

注：表中萌發(fā)率數(shù)據(jù)表示為4個重復的平均值±標準誤，同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：The data of germination rate in the table showed that there were the mean of four replicates ± standard error, and different letters within same row indicate significant difference atP<0.05.

超低溫保存前后花粉萌發(fā)率呈3種變化趨勢：保持不變、升高和降低，花粉變化趨勢與品種和采收季節(jié)有關(guān)。同品種不同季節(jié)的花粉液氮保存前后變化趨勢基本一致，不同的是春季花粉萌發(fā)率變化差異顯著，其中‘仙境’、‘倫特娜’和‘雨果’2個季節(jié)采收的花粉，液氮保存后萌發(fā)率沒有顯著變化；‘金鳳凰’2個季節(jié)采收的花粉液氮保存后均顯著下降，分別下降6.55 %和9.90 %；‘希望’春季花粉液氮保存后萌發(fā)率下降3.06 %，‘金瑪麗’春季花粉液氮保存后萌發(fā)率升高3.02 %，差異顯著。同品種秋季花粉液氮保存前后萌發(fā)率變化趨勢雖然與春季花粉相同，但差異顯著性不一樣?！瘌P凰’同春季花粉一樣，液氮保存后萌發(fā)率顯著下降，其他5個品種液氮保存前后萌發(fā)率沒有顯著變化。

2.4 6個月季品種花粉形態(tài)特征

為探討花粉形態(tài)與超低溫保存效果的關(guān)系，對6個品種花粉形態(tài)進行了電鏡觀察，結(jié)果見表4和圖1。6個品種花粉共同之處，均以單粒形式存在，花粉粒大小中等，極面觀為三裂圓形。有3條梭形萌發(fā)溝，沿極軸方向等間距環(huán)狀分布，長度幾乎達到兩極。花粉粒大小、形狀、萌發(fā)溝大小、孔穴直徑等存在差異。

花粉形狀為長球形和超長球形兩類，極軸長與赤道軸長比值最大的為‘倫特娜’，最小的為‘金鳳凰’；極軸最長的是‘金鳳凰’，最短的是‘雨果’?！畟愄啬取ǚ勖劝l(fā)溝最長，‘希望’最短；‘雨果’花粉溝寬最寬，‘倫特娜’最窄。6種月季花粉外壁均具有條脊，外壁紋飾以條紋狀紋飾為主，覆蓋層穿孔型，但條紋粗細、間距、走向有所不同，‘雨果’條脊最寬，‘金瑪麗’最窄?！瘌P凰’花粉的條脊距最大，達到0.35 μm，其余品種之間無顯著差異。4個品種孔穴直徑為0.26 μm，而‘雨果’最大，‘希望’最小。

表4 6個月季品種花粉形態(tài)特征Table 4 The morphological characteristics of pollen grains of 6 rose cultivars

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note：Different letters within same column indicate significant difference atP<0.05.

結(jié)合花粉液氮保存前后萌發(fā)率測定結(jié)果，可以看到‘金鳳凰’和‘希望’為長球形(極軸長與赤道軸長之比小于2)，超低溫保存后花粉活力呈下降趨勢；而‘金瑪麗’、‘雨果’、‘倫特娜’和‘仙境’為超長球形，超低溫保存后萌發(fā)率基本保持穩(wěn)定或稍有升高(‘金瑪麗’)。從外壁紋飾分析，條脊寬度最窄、條脊間距最小的‘金鳳凰’液氮保存后生活力下降明顯，但與相似的‘倫特娜’液氮保存后生活力卻很平穩(wěn)，沒有顯示出與超低溫保存效果的相關(guān)性。液氮保存效果不同的品種，具有相同或近似的萌發(fā)溝和孔穴數(shù)值，顯示與超低溫保存效果也不相關(guān)。

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代月季品種花粉萌發(fā)的最適蔗糖濃度普遍高于野生種[13]。適于大多數(shù)薔薇屬植物花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為5 %～8 %，超過15 %反而會抑制花粉萌發(fā)和花粉管的伸長[12]；但是也有研究表明，蔗糖濃度為15 %～20 %時最適合豐花月季花粉萌發(fā)[14]。本研究結(jié)果顯示，6個現(xiàn)代月季品種花粉最適宜的蔗糖濃度為15 %，與之基本一致。適宜濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)管的生長，過高則會降低環(huán)境水勢而對花粉萌發(fā)不利[15]，本研究中0.05 %硼酸較利于6個月季品種花粉萌發(fā)。

1 ‘金鳳凰’、2‘金瑪麗’、3‘倫特娜’、4‘仙境’、5‘希望’、6‘雨果’。A. 花粉赤道面觀(×5000)；B. 花粉紋飾(×10000或×20000)；C. 花粉極面觀(×5000)1 ‘Golden Scepter’,2 ‘Goldmarie’,3 ‘Len Turner’,4 ‘Carefree Wonder’,5 ‘Kiboh’,6 ‘Victor Hugo’).A. Pollen Equatorial view(×5000)；B. Pollen exine ornamentation(×10000 or×20000)；C. Pollen polar view(×5000)圖1 6個月季品種的花粉形態(tài)Fig.1 Pollen morphology of 6 rose cultivars

超低溫保存技術(shù)已經(jīng)應用于多種園林植物花粉的長期儲存，但保存效果存在差異[16-17]。在本研究中，6個品種花粉液氮保存后，生活力也同樣呈現(xiàn)平穩(wěn)、升高和降低3種情況，這種變化主要由品種決定，也受花粉采收季節(jié)影響。依據(jù)液氮保存結(jié)果，6個月季品種可分為三類：一類為‘仙境’、‘倫特娜’、‘雨果’，春、秋兩季花粉液氮保存后與新鮮花粉萌發(fā)率均無顯著差異；第二類為‘金瑪麗’，液氮保存后萌發(fā)率呈上升趨勢，春季花粉變化差異達到顯著水平，而秋季未達到顯著水平；第三類為‘金鳳凰’和‘希望’，液氮保存后萌發(fā)率呈下降趨勢，只是秋季采收的‘希望’花粉液氮保存前后差異未達到顯著水平。超低溫保存后花粉生活力的3種變化趨勢在其他花粉超低溫保存中也有類似報道[18-19]。原因尚待進一步研究。

已有大量研究顯示，花粉含水量與液氮保存效果密切相關(guān)，本研究中花粉含水量與液氮保存前后花粉萌發(fā)率都未顯著相關(guān)。主要是由于大多數(shù)植物的花粉在散粉時已處于部分脫水狀態(tài)，一般認為含水量低于20 %的花粉可實現(xiàn)超低溫保存[20-21]。本研究中，春、秋兩季采收的月季花粉含水量均在9 %～12 %范圍內(nèi)，6個品種花粉均實現(xiàn)了超低溫保存，支持該結(jié)論。

6個品種新鮮花粉含水量與萌發(fā)率未顯著相關(guān)。春、秋季花粉含水量基本相似，即便有顯著差異，差值也不大，但是春季花粉萌發(fā)率普遍顯著高于秋季，表明自然散粉階段的花粉，含水量已達到適宜范圍，不成為影響花粉液氮保存前后萌發(fā)率的主要因子。春、秋季花粉液氮保存后生活力變化的差異，即春季花粉與其對照的新鮮花粉變化差異顯著而秋季花粉不顯著，與春季新鮮花粉具有較高的萌發(fā)率有關(guān)。

秋季花粉超低溫保存后花粉萌發(fā)率較其對照的新鮮花粉變化較小，這可能與秋季溫度較低，花粉具有一定的低溫適應有關(guān)。有研究表明，某些物種的花粉在經(jīng)過低溫預冷凍之后，可以增加其超低溫保存后的萌發(fā)率。時婷婷等研究結(jié)果表明預冷處理能夠提高百合花粉超低溫保存后的萌發(fā)率，其中以-20℃的預處理效果最好[22]。李廣清對山茶花粉超低溫保存研究中，預冷凍后的花粉超低溫保存后較未經(jīng)處理花粉萌發(fā)率偏高[10]。在本研究中，春秋季氣溫的差異可能與預冷凍的作用相似。

有研究表明較為原始的被子植物花粉體積比較大，花粉大小演變過程是從大到小進化的[23]。根據(jù)Walker花粉外壁紋飾演化趨勢理論，花粉進化表現(xiàn)為由無結(jié)構(gòu)層(表面光滑)到穿孔、粗糙、條紋狀發(fā)展?；ǚ弁獗诘臈l紋是由分枝粗短、排列不整齊向分枝長且排列整齊演化，并且條脊由寬向窄進化[24]。供試的6個現(xiàn)代月季品種在極軸長、赤道軸長、外壁紋飾、萌發(fā)溝、孔穴直徑間存在一定的差異?；ǚ垡旱４媲昂竺劝l(fā)率測定結(jié)果表明，長球形的‘金鳳凰’和‘希望’，超低溫保存后花粉活力有所下降；而超長球形的‘金瑪麗’、‘雨果’、‘倫特娜’和‘仙境’，超低溫保存后萌發(fā)率基本保持穩(wěn)定。這可能與花粉越長、其體積與表面積之比就越小、調(diào)節(jié)功能越強這個理論有關(guān)[25]。

4 結(jié) 論

綜上所述，6個月季品種春、秋季采收的室內(nèi)自然散粉花粉，均實現(xiàn)了超低溫保存。依品種和花粉采收季節(jié)不同，超低溫保存后花粉生活力呈現(xiàn)不變、升高或降低3種變化。此外，超低溫保存后花粉生活力變化還與花粉形狀、新鮮花粉萌發(fā)率有關(guān)。雖然秋季采收的花粉超低溫保存后萌發(fā)率較新鮮花粉變化較小，但6個品種春季采收的花粉萌發(fā)率均高于或等于秋季花粉，液氮保存后也有更高的萌發(fā)率，因此，更適宜進行超低溫保存。春、秋季花粉含水量相似，但萌發(fā)率明顯不同，液氮保存后生活力變化幅度也不同，其中原因值得進一步研究。