芳樟醇?xì)庀嗫咕钚耘c作用機制

吳克剛，趙欣欣，段雪娟，柴向華，于泓鵬，劉曉麗，范宇婷

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市香思馨情健康科技有限公司，廣東 廣州 510006；3.河南工業(yè)大學(xué) 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

芳樟醇，又名沉香醇、胡荽醇、芫荽醇、沉香油醇、伽羅木醇、里那醇等，是一種無色液體，作為一種單離香料廣泛存在于香紫蘇精油、胡荽籽精油（芫荽油）、芳樟葉精油、芳樟木精油、黃樟精油等植物精油中。天然芳樟醇?xì)馕都冋?、圓和、甜潤、幽雅，具有類似鈴蘭、百合花樣的香氣[1]，同時具有抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)靜、驅(qū)蟲和殺蟲等功效[2-6]，因而可將其應(yīng)用于空氣清新殺菌劑等領(lǐng)域?，F(xiàn)用的消毒劑、殺菌劑和空氣清新劑等基本上都是人工合成的物質(zhì)，在消毒、殺菌、清新空氣的同時也會對人體造成一定的危害，并且氣味不理想[7]，而芳樟醇具有綠色、安全、高效、留香等特點，符合當(dāng)下的趨勢。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對植物精油抗菌活性成分及其作用機制開展了大量研究，主要是從菌體微觀形態(tài)、細(xì)胞膜通透性、新陳代謝等方面的變化來認(rèn)識植物精油液相接觸抗菌的作用機理[8-14]，而關(guān)于芳樟醇的氣相抗菌活性及其作用機制的研究不多。大腸桿菌（Escherichia coli）是人和動物腸道中最常見的一種細(xì)菌，作為細(xì)菌的模式生物被廣泛用于科學(xué)研究。為此，本實驗以大腸桿菌為供試菌，研究芳樟醇的氣相抗菌活性，通過觀察菌體微觀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜通透性的變化來探討其抗菌機制，為植物精油成分氣相抗菌活性的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌ATCC 25922由廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心提供。將菌株于營養(yǎng)肉湯中37 ℃活化24 h，平板劃線分離單個菌落，挑取單個菌落用麥?zhǔn)媳葷峁芘渲瞥?.5麥?zhǔn)蠁挝唬s1.5h 108CFU/mL）的菌懸液，備用。

營養(yǎng)瓊脂、緩沖蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；芳樟醇（98%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；百里香酚（99%）、丁香酚（99%）、茴香腦（99%）、檸檬醛（95%）、檸檬烯（90%）、香葉醇（98%）、香茅醇（99%）、香茅醛（99%）、香芹酚（95%）和大茴香醛（99%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、丙烯酰胺和雙丙烯酰胺 美國Sigma公司；牛血清白蛋白 廣東 光華化工有限公司；蛋白酶K 北京普博欣生物技術(shù)科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海伯奧生物科技有限公司；花生油 山東魯花集團(tuán)有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）有限 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-160HR高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FluoroMax-4熒光光譜儀 法國HORIBA Jobin Yvon公司；JSM-6360LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；S-3000N型掃描電子顯微鏡、H-7650型透射電子顯微鏡 日本日立公司；EM UC6超薄切片機 德國Leica公司；DDS-307T型電導(dǎo)率儀 上海智光儀器儀表有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HP6890氣相色譜儀（配5973質(zhì)譜檢測器） 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單離香料氣相熏蒸大腸桿菌及最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

參考Lopez等[15]的氣相揮發(fā)實驗，在已冷卻至室溫的培養(yǎng)基上加入0.1 mL上述菌懸液，用三角玻璃涂棒涂勻，待菌液完全吸收后將培養(yǎng)板倒置，按設(shè)定的空間含量將各單離香料的稀釋液（丙二醇稀釋）滴加在各培養(yǎng)皿的皿蓋中央，封口膜密封并于37 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察平板長菌情況。以完全不長菌的平板所對應(yīng)的最低濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。完全不長菌的平板無菌更換新的培養(yǎng)皿皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)24 h，仍然不長菌的平板對應(yīng)的最低濃度為最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.2 大腸桿菌表面疏水性分析

采用ANS熒光探針法分析表面疏水性來了解大腸桿菌細(xì)胞壁完整性。用10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）收集經(jīng)芳樟醇處理過的菌體，用分光光度計將各菌懸液調(diào)OD600nm至0.500f 0.005。參照Thennarasu等[16]的方法，取2.5 mL菌懸液和0.5 mL ANS溶液（終濃度為6.67 mmol/L） 加入反應(yīng)試管中，振蕩混勻，用熒光光譜儀在激發(fā)波長380 nm處測定發(fā)射波長400～600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.3 大腸桿菌超顯微結(jié)構(gòu)觀察

取正常培養(yǎng)和經(jīng)200 μL/L芳樟醇處理24 h的大腸桿菌含菌平板，參照Tyagi等[17]的方法固定樣品，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡來觀察大腸桿菌超顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.4 電導(dǎo)率分析

取正常培養(yǎng)和經(jīng)芳樟醇處理的大腸桿菌含菌平板，用無菌水收集菌體，用分光光度計將各菌懸液調(diào)OD600nm至1.000f 0.005，用電導(dǎo)率儀測各菌懸液電導(dǎo)率。

1.3.5 紫外吸收的測定

參考Hammer等[18]的方法，取10 mL OD600nm為1.0的菌懸液在11 000 r/min條件下離心10 min，取3 mL上清液，用紫外分光光度計在260 nm波長處測定OD值。

1.3.6 大腸桿菌DNA電泳分析

取1.5 mL OD600nm為0.5的菌懸液，按DNA提取試劑盒操作在8 000 r/min條件下離心2 min，棄上清液，提取菌體內(nèi)的DNA，以Tris-硼酸緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%凝膠（加入0.06%的GoldView染料），潛水點樣，100 V穩(wěn)壓電泳30 min，于紫外凝膠圖像分析儀下觀察DNA條帶亮度的變化，拍照并分析結(jié)果。

1.3.7 可溶性蛋白質(zhì)量濃度的分析

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量和吸光度之間的回歸方程為：y＝6.376 4x（R2＝0.991 2）。取10 mL OD600nm為1.0的菌液于7 000 r/min離心10 min。參照Bradford[19]的方法，取0.3 mL上清液并將其稀釋至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色液（含體積分?jǐn)?shù)0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250、4.7%乙醇、8.5%磷酸），振蕩混勻，5 min后測其在595 nm波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)樣品的蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.8 SDS-PAGE分析

取3 mL上述OD600nm為0.5的菌懸液，參考He Feng等[20]的方法，12 000 r/min離心10 min取沉淀物，懸于50 μL的TE緩沖液中，按體積比1∶1加入50 μL上樣緩沖液，于沸水浴中煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min，取50 μL上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）。

1.3.9 熒光光譜分析

參考Ye Xiaoli等[21]的方法，取3 mL上述OD600nm為0.5的菌懸液，在激發(fā)波長285 nm處測定發(fā)射波長在300～500 nm范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，進(jìn)行熒光光譜分析。

1.3.10 脂肪酸組成分析

取正常培養(yǎng)和經(jīng)芳樟醇處理的大腸桿菌含菌平板，無菌水收集菌體，參照杜春明等[22]的方法制備樣品。GC條件：程序升溫（初始溫度50 ℃，保持1 min；以 25 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保持1 min；再以 3 ℃/min的速率升溫到230 ℃，保持18 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃）；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL，分流比20∶1。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊，電子能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度： 150 ℃；掃描范圍10～800 amu，進(jìn)行脂肪酸分析。通過計算機檢索，與質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，對脂肪酸成分進(jìn)行鑒定；用自動積分法算出各峰的峰面積，用面積歸一化法計算各脂肪酸成分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個樣品重復(fù)3 次實驗，用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism軟件作圖，其中電導(dǎo)率、可溶性蛋白質(zhì)量濃度等以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳樟醇對大腸桿菌氣相抗菌活性的研究

2.1.1 芳樟醇?xì)庀嗫咕钚耘c幾種單離香料的對比

表 1 單離香料對大腸桿菌抗菌活性的比較Table 1 Comparison of antibacterial activity of isolate aroma compounds against E. coli

氣相熏蒸法得到的各單離香料對大腸桿菌的MIC和MBC如表1所示。由實驗結(jié)果可知，除丁香酚、茴香腦、檸檬烯、檸檬醛、香葉醇、香茅醇和香茅醛在1 000 μL/L時沒有表現(xiàn)抗菌效果外，芳樟醇、香芹酚、百里香酚和大茴香醛對大腸桿菌均具較好的抗菌效果，抗菌能力大小依次為：香芹酚＞百里香酚＞芳樟醇＞大茴香醛。芳樟醇的抗菌作用雖然稍弱于香芹酚和百里香酚，但優(yōu)于其他幾種單離香料。段雪娟[23]、王新偉[24]等采用直接接觸法研究發(fā)現(xiàn)百里香酚和香芹酚對大腸桿菌具有很好的抗菌活性，但茴香腦、檸檬醛也具有較好的抗菌活性，這與本實驗氣相熏蒸法得到的結(jié)果有所不同，主要是因為精油成分的氣相抗菌活性還與其溶解性、揮發(fā)速率等因素有關(guān)[25]。

2.1.2 溶劑對芳樟醇?xì)庀嗫咕钚缘挠绊?/p>

表 2 不同溶劑稀釋的芳樟醇對大腸桿菌抑菌作用的比較Table 2 Comparison of antimicrobial activity of different concentrations of linalool in different solvents against E. coli

由表2可知，不同溶劑稀釋的芳樟醇熏蒸對大腸桿菌的生長產(chǎn)生了不同的抑制效果，冰乙酸稀釋的芳樟醇抑菌效果最強，當(dāng)空間含量為100 μL/L時，就能完全抑制大腸桿菌的生長；其次為丙二醇和無水乙醇稀釋的芳樟醇，當(dāng)空間含量達(dá)到200 μL/L能完全抑制大腸桿菌的生長；然而以花生油為溶劑稀釋的芳樟醇當(dāng)空間含量達(dá)到250 μL/L時依然未顯示抑菌效果。

表 3 不同溶劑對大腸桿菌抗菌作用的比較Table 3 MIC and MBC of linalool in different solvents against E. coli

由表3可以看出，稀釋溶劑冰乙酸對大腸桿菌具有較強的抗菌作用，空間含量達(dá)到250 μL/L時就能對大腸桿菌產(chǎn)生抑菌、殺菌作用；乙醇空間含量要達(dá)到10 000 μL/L 才能產(chǎn)生抑菌、殺菌效果；而丙二醇和植物油對大腸桿菌均沒有顯示出抗菌作用。用冰乙酸和乙醇作為稀釋溶劑時會對芳樟醇的抗菌效果產(chǎn)生一定的干擾；植物油為溶劑時對芳樟醇的抗菌能力具有抑制作用，因此丙二醇作為芳樟醇的溶劑較為適宜。

2.2 芳樟醇對大腸桿菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 芳樟醇對細(xì)胞壁的影響

圖 1 芳樟醇處理對大腸桿菌表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of linalool treatment on surface hydrophobicity of E. coli

由圖1可以看出，隨著芳樟醇含量的增加和處理時間的延長其誘導(dǎo)的熒光強度均大幅度增加，同時最大熒光強度發(fā)生紅移，說明芳樟醇?xì)庀嗵幚韺?dǎo)致大腸桿菌表面疏水性增加，也就是與探針ANS結(jié)合的疏水區(qū)域增多了，這表明芳樟醇破壞了大腸桿菌細(xì)胞壁，使得細(xì)胞膜上越來越多的脂類疏水性磷脂雙分子層區(qū)域暴露出來。Thennarasu等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌經(jīng)過縮氨酸處理后ANS熒光強度增強，最大吸收峰發(fā)生部分藍(lán)移。

2.2.2 芳樟醇對大腸桿菌超顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖 2 芳樟醇處理前后大腸桿菌的透射電子顯微鏡圖（×60 000）Fig. 2 TEM images of E. coli before and after linalool treatment (× 60 000)

圖 3 芳樟醇處理前后大腸桿菌的掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 SEM images of E. coli before and after linalool treatment

透射電子顯微鏡圖顯示正常大腸桿菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、緊密相貼、胞漿濃密、均勻分布（圖2A1和2A2）；經(jīng)芳樟醇處理后，菌體胞壁和細(xì)胞膜邊緣模糊，出現(xiàn)溶解破裂，胞漿變得稀疏、不均勻分布，甚至出現(xiàn)局部凝結(jié)（圖2B1和2B2）。掃描電子顯微鏡圖顯示正常的大腸桿菌呈完整的短棒狀或短圓柱狀，菌體飽滿、充盈、表面圓潤光滑（圖3A）；經(jīng)芳樟醇處理后大腸桿菌菌體表面變得不光滑，呈現(xiàn)皺縮、干癟狀態(tài) （圖3B）。具有抗菌活性的植物精油成分，其由于疏水性更易作用于細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而使細(xì)胞膜的通透性大大增強，使細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)泄漏，并導(dǎo)致菌體死亡[26-27]。從實驗結(jié)果來看，芳樟醇不僅破壞了大腸桿菌的細(xì)胞壁，也破壞了細(xì)胞膜，導(dǎo)致大腸桿菌胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而呈現(xiàn)皺縮、干癟狀態(tài)。

2.3 芳樟醇對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.3.1 芳樟醇對大腸桿菌胞內(nèi)小分子物質(zhì)泄漏的影響

圖 4 芳樟醇處理對大腸桿菌菌液電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effect of linalool treatment on electric conductivity of E. coli suspension

菌體的細(xì)胞壁損傷以及細(xì)胞膜通透性增加會導(dǎo)致一些鉀鹽、磷酸鹽等小分子釋放出，使菌液電導(dǎo)率升高。由圖4可知，菌液的電導(dǎo)率隨著芳樟醇含量增加和處理時間延長而增大。芳樟醇與大腸桿菌作用的前2 h內(nèi)，電導(dǎo)率增加緩慢，2～3 h期間增加快速，之后趨于平緩。Kong Ming等[27]研究殼聚糖對大腸桿菌的抗菌作用也發(fā)現(xiàn)菌液電導(dǎo)率增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏現(xiàn)象。

2.3.2 芳樟醇對大腸桿菌核酸類物質(zhì)泄漏的影響

圖 5 芳樟醇處理對大腸桿菌菌液OD260 nm值的影響Fig. 5 Effect of linalool treatment on OD260 nm of E. coli suspension

圖 6 芳樟醇處理對大腸桿菌胞內(nèi)DNA含量的影響Fig. 6 Effect of linalool treatment on DNA content of E. coli

細(xì)胞膜嚴(yán)重破損時不僅小分子泄漏，DNA、RNA等大分子物質(zhì)也會大量外泄，導(dǎo)致菌液OD260nm升高。由圖5可知，菌液OD260nm隨著芳樟醇含量的增加和處理時間的延長而升高，芳樟醇含量超過200 μL/L后，OD260nm趨于穩(wěn)定；芳樟醇作用前2 h內(nèi)，OD260nm增加緩慢，2～3 h快速增加，之后趨于平緩。Devi等[9]研究丁香酚處理異變形桿菌時，也發(fā)現(xiàn)菌體表面被溶解和出現(xiàn)非選擇性孔洞，導(dǎo)致核酸大分子物質(zhì)泄漏。

如圖6所示，在細(xì)菌總量相同的情況下，隨著芳樟醇處理時間延長菌體內(nèi)DNA量越來越少，以至于到6 h之后已經(jīng)檢測不到DNA，可能是在芳樟醇的長時間作用下，由于細(xì)胞膜嚴(yán)重破損導(dǎo)致DNA大量泄漏。

2.3.3 芳樟醇導(dǎo)致大腸桿菌蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)泄漏的影響

圖 7 芳樟醇處理對大腸桿菌可溶性蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of linalool treatment on soluble protein content of E. coli

由圖7可知，菌液中的可溶性蛋白質(zhì)量濃度隨芳樟醇含量增加和處理時間的延長而增大。在空間含量低于150 μL/L時，菌液可溶性蛋白質(zhì)量濃度增加幅度較小，當(dāng)含量達(dá)到MIC時，可溶性蛋白質(zhì)量濃度迅速增加?？扇苄缘鞍踪|(zhì)量濃度隨處理時間的延長而逐漸增大，20 h之后可溶性蛋白質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。這進(jìn)一步證明芳樟醇處理后菌體細(xì)胞的通透性增強，造成可溶性蛋白質(zhì)滲出。

圖 8 芳樟醇處理對大腸桿菌菌體總蛋白質(zhì)的影響Fig. 8 Effect of linalool treatment on total proteins of E. coli

如圖8所示，隨著芳樟醇與大腸桿菌作用時間延長，蛋白質(zhì)條帶逐漸減少，顏色逐漸變淺，部分蛋白質(zhì)條帶甚至消失。表明經(jīng)過芳樟醇處理，菌體內(nèi)部的蛋白質(zhì)可能被部分分解或泄漏，而導(dǎo)致菌體內(nèi)的總蛋白質(zhì)含量和種類變少。Devi等[9]研究發(fā)現(xiàn)異變形桿菌經(jīng)過丁香酚處理后膜的完整性破壞，蛋白質(zhì)泄漏；錢麗紅等[28]研究表明茶多酚能夠影響金黃色葡萄球菌內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)，處理后大多數(shù)蛋白質(zhì)條帶變淺甚至消失。

2.4 芳樟醇對大腸桿菌菌體蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

圖 9 芳樟醇處理對大腸桿菌熒光強度的影響Fig. 9 Effect of linalool on fluorescence intensity of E. coli

大腸桿菌菌膜的主要成分為蛋白質(zhì)，組成蛋白質(zhì)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基可以產(chǎn)生熒光，當(dāng)這些殘基在蛋白質(zhì)中的位置發(fā)生改變時，熒光強度也會發(fā)生改變，通過熒光強度和峰位的變化可以反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。如圖9所示，大腸桿菌菌液熒光強度隨著芳樟醇含量增加和處理時間延長呈不同程度的增強。表明芳樟醇與大腸桿菌膜蛋白發(fā)生反應(yīng)，使大腸桿菌蛋白內(nèi)源熒光強度變化而引起了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變，提高芳樟醇處理含量和延長處理時間有利于大腸桿菌蛋白分子充分伸展，暴露出更多的生色基團(tuán)，導(dǎo)致熒光強度隨之增強。Kong Ming等[27]的研究也證明抗菌物質(zhì)能夠影響大腸桿菌上膜蛋白結(jié)構(gòu)，可能是與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。

2.5 芳樟醇對大腸桿菌脂肪酸組成的影響

表 4 芳樟醇對大腸桿菌脂肪酸相對含量的影響Table 4 Effect of linalool vapor treatment time on fatty acid composition of E. coli

由表4可知，大腸桿菌經(jīng)芳樟醇處理后，其菌體細(xì)胞脂肪酸的含量隨著作用時間的延長呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化，C13:0和C17:1相對含量隨著處理時間的延長而增多，其中C13:0相對含量增加較為明顯；C18:0相對含量隨處理時間的延長而減少。呂飛[29]的研究也證明復(fù)合精油處理后釀酒酵母體內(nèi)不飽和脂肪酸C14:1和C13:0相對含量明顯升高?？梢?，大腸桿菌經(jīng)芳樟醇?xì)庀嗵幚砗笸ㄟ^合成長鏈飽和脂肪酸減少、不飽和脂肪酸以及較短鏈脂肪酸增多來維持細(xì)胞膜的流動性，同時也提高了細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)更易泄漏出來。

3 結(jié) 論

芳樟醇具有較強的氣相抗菌活性，對大腸桿菌的MIC和MBC均為200 μL/L。大腸桿菌經(jīng)芳樟醇?xì)庀嘌籼幚頃r，首先細(xì)胞壁的完整性受到破壞，使細(xì)胞膜更易暴露于芳樟醇，導(dǎo)致合成生物膜的長鏈飽和脂肪酸減少、不飽和脂肪酸以及較短鏈脂肪酸增多，使細(xì)胞膜流動性增加；同時，導(dǎo)致細(xì)胞膜蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使細(xì)胞膜完整性被破壞。由于芳樟醇導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞膜膜脂組成以及膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使細(xì)胞膜的通透性增加，引起一些維持細(xì)胞正常生長的鉀鹽、磷酸鹽等小分子以及蛋白質(zhì)、DNA、RNA等生物大分子物質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致大腸桿菌死亡。