功能性肽的分離及富集研究進(jìn)展

李欣蔚，廖 佳，董秀瑜，周 新，楊賀棋，武 龍，汪秋寬，周 慧,

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東 珠海 519000）

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是由氨基酸組成的有機(jī)大分子。肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸經(jīng)肽鍵鏈接而成，分子質(zhì)量介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間[1-3]。功能性肽是指具有某種特定生物活性、對(duì)機(jī)體有益的肽類(lèi)化合物[4]。功能性肽廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物機(jī)體中，也可通過(guò)蛋白質(zhì)降解或人工合成得到。來(lái)自于人體的內(nèi)源性功能肽參與機(jī)體代謝，通過(guò)蛋白質(zhì)降解或人工合成的外源性功能肽具有多種有益健康的生理功能。由于功能性肽分子質(zhì)量較小、細(xì)胞透過(guò)性較好、易被人體消化吸收，且毒副作用極低，從而受到食品、藥品、醫(yī)療等領(lǐng)域的高度關(guān)注[5-10]。

功能性肽的結(jié)構(gòu)解析和功能開(kāi)發(fā)一直是肽組學(xué)的研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究開(kāi)發(fā)必須以從混合體系中獲得高純度目標(biāo)肽產(chǎn)品為前提。然而，內(nèi)源性功能肽的豐度很低，存在大量高豐度蛋白及其代謝產(chǎn)物的干擾，尤其是血清中包含著復(fù)雜的蛋白組成，且蛋白質(zhì)含量在大于10 個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)[11]，如何有效地將低豐度內(nèi)源性功能肽從高濃度蛋白混合物中提取出來(lái)具有巨大的挑戰(zhàn)；蛋白降解或人工合成的肽混合物中存在游離氨基酸、不同分子質(zhì)量和氨基酸單元的肽或者蛋白、反應(yīng)助劑等，其產(chǎn)物組成復(fù)雜，通過(guò)簡(jiǎn)單的分離很難獲得某一特定組分。針對(duì)內(nèi)源性功能肽和外源性功能肽目前已經(jīng)發(fā)展出了多種富集和分離方式，例如電泳技術(shù)[12]、膜分離技術(shù)[13]、色譜技術(shù)[14]等， 但是傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)效果往往不理想、適用范圍小，不利于功能性肽的進(jìn)一步研究。近年來(lái)，科研人員研究報(bào)道了多種新型的分離富集方法及新型材料。本文對(duì)現(xiàn)有的分離和富集技術(shù)進(jìn)行梳理總結(jié)，并闡述了各種方法的原理、適用對(duì)象、優(yōu)缺點(diǎn)以及發(fā)展方向，以期為功能性肽的理論研究與開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 功能性肽的分類(lèi)

功能性肽通常是由兩個(gè)及兩個(gè)以上的α-氨基酸組成的具有特殊活性的肽類(lèi)[15]。其分子質(zhì)量一般小于6 ku[16]，氨基酸組成和分子排列方式不同，其具有的生理功能不同。根據(jù)生物活性可以將功能性肽分為抗氧化肽、抗菌肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗腫瘤肽、免疫活性肽等[17]；按照來(lái)源分為內(nèi)源性功能肽和外源性功能肽。凡源于人體自身的肽被稱(chēng)為內(nèi)源性功能肽；而外源性功能肽指人體之外的、存在于動(dòng)植物和微生物中的肽，以及經(jīng)蛋白質(zhì)降解、氨基酸合成得到的肽。

1.1 外源性功能肽

人體以外的功能性肽類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)為外源性功能肽。按照獲得途徑不同，可以分為蛋白質(zhì)降解肽、其他生物體內(nèi)天然肽和氨基酸合成肽。蛋白質(zhì)降解肽是通過(guò)酶解、微生物發(fā)酵、化學(xué)或物理等方法將蛋白質(zhì)降解為具有功能活性的肽類(lèi)。蛋白質(zhì)降解肽是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)片段，一般由3～20 個(gè)氨基酸殘基組成[18]，具有抗氧化[19]、抗腫瘤[20]、抗炎[21]、抗菌[22]、抗高血壓[23]等多種生物活性。肽的結(jié)構(gòu)特性如鏈長(zhǎng)、氨基酸組成、物理化學(xué)性質(zhì)等[24]決定了其功能活性。

Shazly等[25]通過(guò)堿性蛋白酶、胰蛋白酶分別降解水牛乳酪蛋白和牛乳酪蛋白，獲得了兩種抗氧化肽牛酪蛋白水解物UF-VI CNH和水牛酪蛋白水解物UF-VI CBH，通過(guò)羥自由基清除能力、超氧化合物清除能力、氧自由基吸收能力以及Fe3＋還原能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)采用堿性蛋白酶酶解得到的水牛酪蛋白水解物相對(duì)于牛酪蛋白水解物含有較多的疏水性氨基酸，具有較高的抗氧化活性。馬儷珍等[26]以鯰魚(yú)頭、骨為原料和以脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度為指標(biāo)，探究了具有免疫活性的鯰魚(yú)膠原多肽的優(yōu)化酶解條件，發(fā)現(xiàn)經(jīng)木瓜蛋白酶酶解、加酶量為1 600 U/g、酶解4 h、酶與底物質(zhì)量濃度比1∶4.5時(shí)，酶解肽對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖刺激效果最好。

人體以外的動(dòng)植物及微生物體內(nèi)也存在多種生物活性肽。王一名等[27]發(fā)現(xiàn)磷酸化南極磷蝦肽能夠改善大鼠骨質(zhì)疏松癥，顯著降低大鼠的高骨轉(zhuǎn)換率，顯著改善骨微結(jié)構(gòu)，提升骨密度；胡婧婷等[28]利用反相高效液相色譜法從人參中提取出了糖肽，以經(jīng)β淀粉樣蛋白25-35處理的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)人參糖肽能夠有效抑制PC12細(xì)胞凋亡，當(dāng)糖肽的質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，PC12細(xì)胞存活率達(dá)到（114.84f 6.23）%，促進(jìn)了細(xì)胞增殖，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

氨基酸合成肽是指由氨基酸合成的具有特定序列的肽。Mirzaei等[29]以釀酒酵母蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物純化的活性肽（YGKPVAVPAR）為模板，合成了4 種不同的新型血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽（YHR-10、GA-8、GHA-8、PAR-3），該研究發(fā)現(xiàn)改變氨基酸組成，在C末端區(qū)域加入/替換疏水性殘基Pro可以提高ACE抑制活性。Gu Longjian等[30]基于谷胱甘肽合成了兩種新型肽，即ECH（Glu-Cys-His）和YECG（Tyr-Glu-Cys-Gly），其中三肽ECH顯示出最高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（80.16%）和最強(qiáng)的Fe3＋還原能力（A700nm＝0.378），四肽YECG對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12表現(xiàn)出了最佳抗損傷能力；研究還發(fā)現(xiàn)His或Tyr的存在和其位置的改變均會(huì)影響合成肽的電子供給能力或氧自由基吸收能力，從而影響合成肽的抗氧化活性。由此可見(jiàn)，對(duì)氨基酸合成肽的研究有利于探索生物活性肽結(jié)構(gòu)與其活性之間的關(guān)系。

1.2 內(nèi)源性功能肽

內(nèi)源性功能肽是天然存在于人體內(nèi)，參與人體代謝、運(yùn)輸、免疫、調(diào)節(jié)等各項(xiàng)生理活動(dòng)的肽類(lèi)，具有極其重要的作用，如神經(jīng)肽、肽激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞內(nèi)蛋白水解產(chǎn)物等，一般由3～50 個(gè)氨基酸構(gòu)成[31]。人體內(nèi)的內(nèi)源性功能肽分為兩種：一是天然存在的肽段，例如生長(zhǎng)因子，通常具有特定的生物活性；二是經(jīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)降解所得的肽段[32]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是產(chǎn)生內(nèi)源性功能肽的必要過(guò)程，包括糖基化、乙?；⒘姿峄?、甲基化、硫化、羧基化等。

糖肽是一種重要的內(nèi)源性功能肽，對(duì)細(xì)胞表面識(shí)別、免疫應(yīng)答、蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)等生物轉(zhuǎn)化過(guò)程有著重要作用[33]。糖肽具有微觀不均一性，同一蛋白質(zhì)具有不同的糖基化位點(diǎn)，并且同一位點(diǎn)上的糖鏈也有可能不同[34]，糖基化多種多樣的形式為糖肽的研究帶來(lái)了困難。近年來(lái)，研究者們通過(guò)親水作用色譜法[35]、凝集素 法[36]、硼酸修飾法[37]、酰肼化學(xué)法[38]等，從血清、尿液等樣本中分離富集到了內(nèi)源性糖肽，為部分疾病的研究及治療提供了依據(jù)和基礎(chǔ)，推動(dòng)了肽組學(xué)的發(fā)展。

蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的、將ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）上的過(guò)程[39]。磷酸化修飾是一種可逆的蛋白質(zhì)修飾，通過(guò)磷酸化修飾可以調(diào)控蛋白質(zhì)活性、影響信號(hào)傳遞過(guò)程[40]。蛋白質(zhì)的磷酸化在生物體內(nèi)普遍存在，它與生命體的健康、疾病息息相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化及去磷酸化的變化，可以掌握其生物活性調(diào)控的主要方式。

2 外源性功能肽的分離純化

肽可用于功能性食品、藥物（抗癌、抗炎等）、化妝品的研發(fā)等[41]。通過(guò)蛋白質(zhì)降解或氨基酸合成得到的外源性功能肽是由游離氨基酸、不同分子質(zhì)量的氨基酸組成的肽段、大量無(wú)機(jī)鹽以及未水解蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的混合物。為了獲得具有特定分子質(zhì)量和氨基酸組成且具有特定功能活性的肽段，必須對(duì)混合物進(jìn)行分離純化。不同的肽分子具有不同的分子質(zhì)量、帶電性質(zhì)以及不同性質(zhì)（親/疏水性、酸/堿性）的官能團(tuán)，因此可以利用這些不同性質(zhì)對(duì)混合物進(jìn)行分離?，F(xiàn)階段常用的分離純化方法有電泳技術(shù)、膜分離技術(shù)、色譜技術(shù)以及多種方法聯(lián)用等。隨著肽組學(xué)的研究深入，又出現(xiàn)了一些新型的分離方法及分離材料，例如介孔材料、探針等[42-44]。

2.1 膜分離技術(shù)

膜分離不同于傳統(tǒng)意義上的過(guò)濾，其可以在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行肽混合物的精準(zhǔn)分離，是單純的物理作用，具有操作簡(jiǎn)單、不影響樣品活性、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)。根據(jù)膜的孔徑大小可以分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等。目前，超濾技術(shù)已經(jīng)普遍用于酶解產(chǎn)物的分級(jí)分離中。

楊曉泉等[45]利用3、5 ku和10 ku的切向流超濾膜將大豆肽分為4 級(jí)，其中78.46%的大豆肽分子質(zhì)量集中在5 ku以下，并研究了不同級(jí)分的功能特性。Butylina等[46]選用超濾（再生纖維素C10F膜）和納濾（NTR 7450膜）組合對(duì)乳清衍生肽進(jìn)行分級(jí)分離，并對(duì)甜乳清生產(chǎn)蛋白濃縮后獲得的滲透物中的殘留肽進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)鑒定。然而超濾不能分離游離氨基酸、寡肽、糖、非蛋白氮和鹽，納濾只能將肽和乳糖分開(kāi)，其他成分并不能有效去除。

膜分離技術(shù)通常作為肽分離純化的第一步，不需化學(xué)反應(yīng)，在常溫條件下進(jìn)行，過(guò)程簡(jiǎn)單，適宜大量混合物的分離。但是一定分子質(zhì)量范圍內(nèi)存在著大量結(jié)構(gòu)相似、質(zhì)量相近的肽段；除此之外，肽的分離純化容易受到脫鹽的影響[47]。膜材料也容易堵塞和污染，不利于資源的回收與利用。因此，對(duì)于肽的分離純化，膜分離技術(shù)的選擇性并不高。

2.2 電泳技術(shù)

在電場(chǎng)的作用下，帶電粒子向著與之電荷相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳。電泳技術(shù)是基于電遷移的高性能分離技術(shù)[48]，被廣泛用于蛋白質(zhì)的分離。高效毛細(xì)管電泳分離利用毛細(xì)管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的電泳槽，效率提高了幾十倍，并且具有快速、高分辨率的特點(diǎn)[49]。用于肽分離的毛細(xì)管電泳有毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管等速電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管凝膠電泳、親和毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管免疫電泳、芯片式毛細(xì)管電泳、陣列毛細(xì)管電泳等[50]。 Messana等[51]發(fā)現(xiàn)緩沖溶液的pH值影響肽的遷移率，進(jìn)而影響毛細(xì)管電泳分離肽的效果。

陳均志等[52]采用毛細(xì)管電泳無(wú)膠篩分方式對(duì)復(fù)合酶處理的大豆蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離。通過(guò)使用pH 8.5的緩沖液（含100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷/鹽酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%聚氧化乙烯、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基硫酸鈉），運(yùn)行電壓為10 kV，分離出7 個(gè)不同的肽組分，分子質(zhì)量集中在2 000～8 000 u。楊銘等[53]采用凝膠過(guò)濾及毛細(xì)管電泳對(duì)雙酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）降解的酪蛋白產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，經(jīng)毛細(xì)管電泳共分離出38 個(gè)肽段，分子質(zhì)量范圍為400～800 u。

電泳技術(shù)具有分辨率高、分離速度快的特點(diǎn)，但是進(jìn)樣量少、光路短，限制了其在肽分離純化中的大規(guī)模制備及應(yīng)用。

2.3 色譜技術(shù)

色譜技術(shù)是最為普遍的肽分離純化方法。色譜技術(shù)的原理是利用混合組分物理、化學(xué)性質(zhì)的差異，使其在固定相和流動(dòng)相中的分布程度不同，使各組分的移動(dòng)速度不同，從而達(dá)到分離的目的[54]。常用的色譜技術(shù)有大孔樹(shù)脂吸附層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析、反相高效液相色譜法等。

2.3.1 大孔樹(shù)脂吸附層析

大孔樹(shù)脂可將吸附和篩選相結(jié)合，利用各組分吸附力和分子質(zhì)量大小不同進(jìn)行分離。大孔樹(shù)脂具有回收率高、選擇性好、分離效率高、吸附條件溫和等特點(diǎn)[55]，廣泛用于色素、多酚、生物活性肽等水溶性化合物的分離提純[56]。

許英一等[57]選用6 種大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白肽進(jìn)行分離，篩選出具有最佳分離效果的樹(shù)脂為DA201-C型；DA201-C型樹(shù)脂為非極性，對(duì)疏水性較強(qiáng)的苜蓿葉蛋白肽的吸附性較強(qiáng)；優(yōu)化后的分離工藝為：上樣流速 0.5 mL/min、上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL、洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液、洗脫流速0.5 mL/min、洗脫體積200 mL；與優(yōu)化前工藝相比，苜蓿蛋白肽的純度提高了46.95%。

大孔樹(shù)脂的比表面積及孔徑相對(duì)較大，吸附容量大、分離快速并且可以循環(huán)利用。但是用于分離大小相似的肽組分時(shí)效果較差，且容易受到有機(jī)物污染。

2.3.2 凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾層析又稱(chēng)排阻層析或分子篩層析，根據(jù)分子質(zhì)量的不同將各組分進(jìn)行分離。常用的填料為聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠。凝膠過(guò)濾層析的分離效果與截止尺寸、空隙體積和柱體積等因素 密切相關(guān)[58]，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、過(guò)程簡(jiǎn)便、無(wú)化學(xué)變化等特點(diǎn)[59]，廣泛用于蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的分離純化。

王佳佳等[60]通過(guò)超濾、葡聚糖凝膠柱（Sephadex G-25）分離純化具有肝修復(fù)作用的文蛤寡肽，首先采用截留分子質(zhì)量為5 ku的超濾膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，分子質(zhì)量小于5 ku的混合肽采用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步分離純化，得到目標(biāo)肽，其氨基酸序列為Gln-Leu-Asn-Trp-Asp。 周涵黎等[61]建立了凝膠過(guò)濾色譜（Superdex peptide 10/300GL）分離洋蔥多肽的工藝，得到的目標(biāo)肽對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分別為53.8%和92.6%。

雖然凝膠過(guò)濾層析能夠分離酶解產(chǎn)物中的活性物質(zhì)，但對(duì)于分子尺寸相近的肽，無(wú)法進(jìn)一步純化。凝膠過(guò)濾的分離效果易受到基質(zhì)顆粒的大小及均勻程度的影響，常與其他分離方法（例如超濾等）聯(lián)用才能達(dá)到最終分離純化的目的。

2.3.3 離子交換層析

離子交換色譜是依據(jù)樣品各組分所帶電荷不同，與固定相上的離子交換基團(tuán)相互作用的程度不同實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。吸附和解吸附是離子交換的兩個(gè)主要步驟。離子交換色譜現(xiàn)已普遍應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、肽的分離純化之中[62]。

陳季旺等[63]采用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換層析技術(shù)分離米糠蛋白酶解物超濾透過(guò)液中的類(lèi)阿片拮抗肽，類(lèi)阿片拮抗肽的等電點(diǎn)為6.0，當(dāng)pH值小于5.0時(shí)，大部分肽段易于吸附，因此最適上樣pH值為5.0；經(jīng)離體豚鼠回腸檢測(cè)，分離得到的具有活性的目標(biāo)肽最低質(zhì)量濃度為2 mg/mL，比超濾透過(guò)液的活性高。

與凝膠過(guò)濾法相比，離子交換的色譜基質(zhì)會(huì)與目標(biāo)肽結(jié)合，易受到洗脫液的影響，并且對(duì)于帶電荷數(shù)相似的組分難以分離。離子交換層析通常與其他分離方法聯(lián)用以獲得較好的分離效果。

2.3.4 親和層析

親和層析一般用于分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子物質(zhì)，依據(jù)生物分子與配體之間可逆且專(zhuān)一的結(jié)合能力進(jìn)行分離[64]，具有高選擇性、高回收率的特點(diǎn)[65]。親和色譜可分為免疫親和色譜、金屬離子親和色譜、擬生物親和色譜（例如肽親和色譜）[66]。

查娟等[67]以醋酸乙烯酯-甲基丙烯酸烯丙酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯三元共聚物為基質(zhì)，制備硼酸親和色譜固定相，用于分離純化云芝糖肽，優(yōu)化的吸附緩沖液為含0.4 mol/L NaCl的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.5），洗脫液為0.2 mol/L硼酸溶液；純化云芝糖肽的蛋白含量與未優(yōu)化之前相比提高了2.65 倍，糖含量提高了66%。硼酸共價(jià)親和色譜具有很高的選擇性，能夠?qū)⒉煌Y(jié)構(gòu)的多糖肽分離。目前，親和層析與其他色譜方法聯(lián)用常用于蛋白等物質(zhì)的生物分析。

2.3.5 反相高效液相色譜法

在高效液相色譜中，當(dāng)流動(dòng)相極性大于固定相極性時(shí)，即為反相高效液相色譜。反相高效液相色譜是根據(jù)樣品與固定相之間的疏水作用差異進(jìn)行分離。疏水作用弱或親水的物質(zhì)保留時(shí)間短，容易被排出，反之，疏水性相對(duì)較強(qiáng)的組分在柱內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)[68-69]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、多肽分子通過(guò)色譜柱時(shí)，會(huì)發(fā)生去折疊使內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，從而與疏水固定相相互作用，因此反相色譜技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)/多肽的分離純化[70]。反相色譜的固定相一般為硅膠，水用作基礎(chǔ)溶劑，常用的有機(jī)溶劑有甲醛、乙腈等[71]。

孫冰玉等[72]采用反相高效液相色譜對(duì)大豆蛋白外啡肽β-CM-3進(jìn)行定性定量的檢測(cè)。優(yōu)化的分離條件為：柱溫25 ℃，柱壓9.0 MPa，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)15%乙腈-0.1%三氟乙酸-水，等度洗脫，流速0.9 mL/min，洗脫時(shí)間60 min。標(biāo)準(zhǔn)肽的平均回收率為95.3%，分離的精密度、準(zhǔn)確性、靈敏度均能滿足要求。

反相高效液相色譜已廣泛應(yīng)用于功能性肽的分離純化，其穩(wěn)定性好、分離效率高、適用性廣，對(duì)于分子質(zhì)量小的樣品分離效果顯著。然而，反相高效液相色譜的分離效果受到諸多因素的影響，例如pH值、流速、溫度、流動(dòng)相等，其中pH值的影響最為顯著。

2.4 其他新型分離方法及材料

隨著科技的發(fā)展，常用的色譜、膜分離等方法呈現(xiàn)操作復(fù)雜、過(guò)程重復(fù)、儀器設(shè)備要求高、價(jià)格昂貴、樣品損失多、易造成環(huán)境污染等問(wèn)題，研究者們正在尋求高效快速的新方法和新材料，實(shí)現(xiàn)肽的分離純化。

2.4.1 生物探針技術(shù)

生物探針技術(shù)依據(jù)合成探針與目標(biāo)肽的特異性結(jié)合，使目標(biāo)肽從酶解產(chǎn)物中分離出來(lái)。Fields等[73]鑒定出一組靶向Bowman-Birk抑制劑（Bowman-Birk inhibitor，BBI）的新合成肽，并證明了其在體外結(jié)合BBI的能力，將純化的合成肽共價(jià)固定在超順磁性微球上，用于進(jìn)一步從大豆乳清混合物中分離BBI。這種方法創(chuàng)造了一步分離的可能，簡(jiǎn)化了分離步驟，從而降低了分離成本。

2.4.2 納米材料

納米材料具有孔徑可調(diào)及表面可修飾官能團(tuán)的特點(diǎn)，極大地促進(jìn)了在生物分子的分離與識(shí)別方面的 應(yīng)用[74]。依據(jù)目標(biāo)肽的理化性質(zhì)，合成的多孔聚合物納米材料能對(duì)其進(jìn)行特定的分離純化。

Lan Xiongdiao等[75]采用反相微乳法制備了磁性瓊脂糖微球，用以分離純化蜥蜴魚(yú)纖維蛋白ACE抑制肽。該研究將磁性瓊脂糖微球經(jīng)環(huán)氧基團(tuán)修飾后，再在其外表面固定ACE，得到的微球可作為磁性介質(zhì)分離分子質(zhì)量小于5 ku的超濾水解產(chǎn)物。傳統(tǒng)的ACE抑制肽分離純化方法過(guò)程繁瑣、處理時(shí)間較長(zhǎng)，具有一定的局限性。通過(guò)固定ACE的納米材料，可以實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的一步分離純化，方便快捷。

2.5 多種方法聯(lián)用

采用一種方式對(duì)蛋白質(zhì)、肽等物質(zhì)進(jìn)行分離純化，很難達(dá)生物分析的標(biāo)準(zhǔn)。多種方式聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)肽混合物的精準(zhǔn)分級(jí)分離，以獲得高純度的肽組分。

2.5.1 超濾-凝膠過(guò)濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用

謝曉霞等[76]采用3 ku的超濾膜、葡聚糖凝膠柱SephadexG-15和反相高效液相色譜從文蛤中提取呈味物質(zhì)，并制備小分子的鮮味肽，最終從7 個(gè)鮮味組分中分離純化得到了一種新型鮮味九肽。Pan Saikun等[77]使用類(lèi)似的方法從滸苔蛋白的酶解產(chǎn)物中分離純化ACE抑制肽；通過(guò)截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾膜，將酶解產(chǎn)物分成兩個(gè)級(jí)分，并對(duì)活性最高的級(jí)分進(jìn)一步利用凝膠過(guò)濾和反相高效液相色譜進(jìn)行純化，所得純化肽的ACE抑制活性的半抑制濃度（50% of inhibitory concentration，IC50）為35.9 μmol/L； 體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)顯示，純化得到的ACE抑制肽具有較低的胃腸道酶敏感性。

2.5.2 離子交換色譜-凝膠過(guò)濾色譜-高效液相色譜聯(lián)用

管驍?shù)萚78]分離純化燕麥蛋白的胰蛋白酶水解產(chǎn)物，首先采用陽(yáng)離子交換劑SP-Sephadex C-25和陰離子交換劑DEAE Sepharose Fast Flow，取2.5 mL酶解產(chǎn)物上樣；取活性最高的組分利用Sephadex G-25凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行分離，上樣量為2 mL，蒸餾水洗脫；最后取最高活性的組分利用C18（250 mmh 10.0 mm，10 μm）和BDS-C18（250 mmh 4.6 mm，5 μm）固定相進(jìn)行兩次反相高效液相分離，重復(fù)進(jìn)樣，多次收集。所得目標(biāo)肽ACE抑制活性的IC50為77.3 μmol/L，氨基酸序列為Glu-Gly-Gly-Tyr-Arg。

大部分肽都以非活性形式存在于天然物質(zhì)中，因而外源性功能肽的分離重點(diǎn)在于達(dá)到分離純化的效果，同時(shí)保障功能性肽的自身活性。目前所使用的分離手段存在許多缺陷，例如過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、不環(huán)保、提取率低、成本較高，分離方法也可能會(huì)影響肽的活性等。通常采用一種方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離純化，多種方式聯(lián)用逐漸成為外源性功能肽分離的發(fā)展趨勢(shì)。

3 內(nèi)源性功能肽的富集

內(nèi)源性功能肽控制并影響生物體內(nèi)的代謝過(guò)程，其數(shù)量和功能與人的生理及病理狀態(tài)直接相關(guān)，是潛在的生物標(biāo)記物[79]。然而，含有內(nèi)源性功能肽的生物樣品中一般含有豐度和種類(lèi)差異巨大的蛋白質(zhì)組分，具有研究?jī)r(jià)值的內(nèi)源性功能肽成分濃度極低（小于1 nmol/L）[80]，且蛋白質(zhì)和內(nèi)源性功能肽的物理化學(xué)性質(zhì)極其相似。因此，內(nèi)源性功能肽在富集過(guò)程中容易受到高豐度蛋白及其他復(fù)雜成分的影響，選擇性高效富集低豐度內(nèi)源性功能肽成為生物分析的難點(diǎn)問(wèn)題。糖基化和磷酸化是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在生物體的調(diào)節(jié)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。因此，糖肽及磷酸肽的富集逐漸成為肽組學(xué)中的一個(gè)重要課題。按照肽的種類(lèi)，富集方法可以分為糖肽的富集、磷酸肽的富集以及其他小分子肽的富集。

3.1 糖肽的富集

糖基化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾之一，人體內(nèi)約有一半以上的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生糖基化[81]。研究發(fā)現(xiàn)糖基化會(huì)影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及傳導(dǎo)運(yùn)輸，且蛋白質(zhì)糖基化程度及糖鏈的結(jié)構(gòu)變化也是導(dǎo)致疾?。ㄈ绨┳儯┌l(fā)生的重要標(biāo)志。糖肽的富集是糖基化研究的一個(gè)重要組成部分，也是肽組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟之一。糖肽的富集方法主要有凝集素親和法、肼化學(xué)法、硼酸化學(xué)法、親水作用法等。

3.1.1 凝集素親和法

凝集素是一種可與多糖結(jié)合的蛋白，是最早運(yùn)用于糖肽富集的物質(zhì)。常用的凝集素材料有選擇性結(jié)合甘露糖的伴刀豆凝集素A[82]、結(jié)合N-乙酰神經(jīng)氨酸單元的接骨木凝集素[83]、與巖藻糖相結(jié)合的橙黃網(wǎng)胞盤(pán)菌凝集素[84]、 選擇性識(shí)別N-乙酰葡糖胺的小麥胚芽凝集素[85]等。凝集素親和法的缺陷在于它只能與其識(shí)別的糖型結(jié)合，在選定凝集素的情況下，只有選擇性吸附特定組成的部分糖肽。如何更多地選擇性覆蓋糖肽種類(lèi)及數(shù)量是凝集素富集的研究重點(diǎn)。Pan Yiting等[86]根據(jù)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的原理，合成了一種以二氧化硅為內(nèi)核、刷狀聚合物鏈為外殼的納米微粒。柔性非交聯(lián)聚合物鏈增加了凝集素和糖肽的結(jié)合位點(diǎn)，提高了凝集素的負(fù)載量，減小了空間位阻，改善了兩者的可接近性。

3.1.2 肼化學(xué)法

肼化學(xué)法富集糖肽的過(guò)程包括將糖鏈上的順式鄰二醇氧化成醛；醛基與固相支持物上的酰肼基團(tuán)共價(jià) 偶聯(lián)[87]。與凝集素親和法不同，肼化學(xué)法可以吸附所有的糖蛋白。

Bai Haihong等[88]將酰肼功能化親水聚合鏈固定在氧化石墨烯表面，用于選擇性富集N-糖肽，在實(shí)際樣品應(yīng)用方面，從人血清樣本中鑒定出了385 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、371 個(gè)N-糖肽和187 個(gè)N-糖蛋白，是已報(bào)道數(shù)量的3 倍。表明肼化學(xué)法可以應(yīng)用于生物標(biāo)記物的大規(guī)模篩選，以深入研究血清N-糖蛋白組。

3.1.3 硼酸化學(xué)法

在堿性溶液中，糖鏈上的順式鄰位和硼酸基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成環(huán)狀二酯，從而進(jìn)行糖肽的吸附；在酸性溶液中，發(fā)生堿性溶液中的可逆反應(yīng)，即環(huán)狀二酯水解，從而實(shí)現(xiàn)糖肽的解吸。硼酸易于獲得，穩(wěn)定且適用性強(qiáng)。Liu Liping等[89]選用硼酸化修飾的TiO2納米材料改性棉絮，通過(guò)親水相互作用色譜富集糖肽；這種方式去除了大量的非糖肽，從辣根過(guò)氧化物酶消化產(chǎn)物中檢測(cè)到了26 種糖肽。雖然硼酸化學(xué)法具有獨(dú)特的可逆性，但是結(jié)合系數(shù)較弱，不能廣泛用于糖肽的分析。Zhang Yong等[90]開(kāi)發(fā)了能夠在堿性及酸性條件下穩(wěn)定存在的新型苯基硼酸功能化材料，用于糖肽的富集；該種功能化材料具有低檢測(cè)限（0.33 fmol/μL）、高濃縮效率（78.7%），以及高回收率（約90%），能夠從5 μL人血清中鑒定出209 種糖蛋白中的463 種糖肽。Xie Yiqin等[91]合成了硼酸功能化磁性金屬-有機(jī)骨架復(fù)合材料，該復(fù)合材料含有大量的硼酸位點(diǎn)和高靈敏度（0.5 fmol/μL），且具有磁性、便于分離，能在提高富集效率的同時(shí)節(jié)省大量的操作時(shí)間。

3.1.4 親水作用法

糖肽中還有大量的羥基，可以依據(jù)其較強(qiáng)的親水性與非糖肽分離。Li Ya等[92]通過(guò)“一鍋法”合成大孔吸附樹(shù)脂@微孔有機(jī)聚合物功能化樹(shù)脂（macroporous adsorption resin @ microporous organic polymers，MAR@MOP），該材料的比表面積為131.3 m2/g，遠(yuǎn)高于原始MAR（57.8 m2/g），三相接觸角由58.8°（MAR）下降到24°，具有良好的親水作用；將其運(yùn)用于小鼠肝臟胰蛋白酶消化液的富集，在100 μg樣品中鑒定出了516 種糖基化蛋白中879 個(gè)獨(dú)特的N-糖基化位點(diǎn)。為了解決低回收率的問(wèn)題，Peng Yahui等[93]將聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）接枝在硅膠（silica gel，Sil）上得到PEI-Sil，作為親水作用吸附的固定相，當(dāng)目標(biāo)糖肽與非糖肽質(zhì)量比為1∶3 000時(shí)，PEI-Sil仍能表現(xiàn)出優(yōu)異的富集能力。Song Yongyang等[94]通過(guò)乳液界面聚合法制備了孔徑可調(diào)并具有親/疏水基團(tuán)的異質(zhì)結(jié)構(gòu)納米顆粒，用于低豐度糖肽的分離，首先通過(guò)具有大孔結(jié)構(gòu)、疏水基團(tuán)的納米顆粒去除高豐度疏水蛋白及非糖肽，再用具有小孔結(jié)構(gòu)、親水基團(tuán)的納米顆粒有效吸附親水性的糖肽；經(jīng)質(zhì)譜分析，制得的納米顆粒富集了22 個(gè)糖 肽信號(hào)。

3.2 磷酸肽的富集

磷酸化肽的富集容易受到高豐度蛋白的影響[95]。如何高效快速地富集磷酸化肽段是近年肽組學(xué)的研究熱點(diǎn)。磷酸肽的富集方法主要有親和色譜富集法、離子交換色譜法。

3.2.1 親和色譜法

磷酸肽的親和色譜法富集主要分為金屬氧化物親和色譜（metal oxide affinity chromatography，MOAC）法、固定化金屬離子親和色譜（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）法和金屬有機(jī) 骨架法。

MOAC是基于金屬氧化物與磷酸基團(tuán)的親和作用，常用的金屬氧化物有以及ZnO[100]等。其中，TiO2是最早也是最廣應(yīng)用的材料。Hong Yayun等[101]合成了具有較大比表面積和孔體積的中孔TiO2納米材料，其大孔徑及中空結(jié)構(gòu)能夠有效防止富集中的“陰影效應(yīng)”；與小孔TiO2磁性材料相比，中空結(jié)構(gòu)的TiO2材料顯示出更高的富集選擇性和更低的磷酸檢測(cè)限（0.2 fmol/μL）。

IMAC材料的合成比MOAC材料的合成操作簡(jiǎn)單，易于控制。隨著磷酸肽富集研究的深入，發(fā)現(xiàn)IMAC材料中螯合化合物的富集效果嚴(yán)重依賴(lài)于吸附/洗脫條件，研究者們以此為改進(jìn)技術(shù)的突破口，不斷制備出新型材料。Hong Yayun等[102]通過(guò)PEI、植酸和Ti4＋合成了具有良好親水性的磁性二氧化硅微球，用于磷酸肽富集，從2 μL人血清中鑒定出132 個(gè)（總共276 個(gè)）糖蛋白的N-糖肽，從200 μg HeLa細(xì)胞提取物中鑒定出704 個(gè)磷蛋白上的磷酸肽。Zhu Baode等[103]將Bi3＋、Fe3＋和Zr4＋3 種金屬陽(yáng)離子加入至TiO2中，合成了TiO2/Bi/Fe/Zr納米復(fù)合材料，增加了材料的吸附位點(diǎn)。經(jīng)Fe3＋和Ti4＋修飾的納米材料分別對(duì)酸性和堿性磷酸肽具有不同的結(jié)合親和力[104]。組合不同的金屬離子可提高磷酸肽的富集效率和選擇性。

金屬有機(jī)骨架是用于磷酸肽富集的新型多孔材料，與MOAC和IMAC材料相比，具有較大的孔內(nèi)比表面積和較好的富集效果。Xie Yiqin等[105]選用磁性鉺（Er）合成了金屬有機(jī)骨架材料Fe3O4@PDA@Er。在20 amol/μL的檢測(cè)限內(nèi)仍能檢測(cè)到人血清樣本中的5 個(gè)磷酸肽峰，說(shuō)明該合成材料具有超高的靈敏性和選擇性。Zhou Jianqiao等[106]制備了雙功能磁性鋯基金屬有機(jī)骨架，該納米顆粒中固有的Zrü O基團(tuán)起到MOAC的作用，固定的Ti4＋起到IMAC的作用，結(jié)合了IMAC和MOAC的親和能力，具有大表面積（237.9 m2/g）和高結(jié)合力（100 mg/g），以及良好的富集回收率（84.8%）。

3.2.2 離子交換色譜法

離子交換色譜主要依據(jù)磷酸肽和非磷酸肽的電荷差異實(shí)現(xiàn)磷酸肽的富集。溶液的pH值是影響磷酸肽特異性吸附的重要因素。Alpert等[107]利用陰離子交換色譜富集磷酸肽，發(fā)現(xiàn)在pH值大于5的溶液中，磷酸肽帶負(fù)電荷，在陰離子交換色譜（anion exchange chromatography，AEX）中保留完好；而當(dāng)pH值小于2時(shí)，則有利于從未修飾的酸性肽中分離磷酸肽。在此基礎(chǔ)上，Zhu Gangtian等[108]制備了高耐酸性的磁性straticulate-C3N4材料，這種AEX材料在pH值小于1.8的環(huán)境下仍能保持較高的特異性吸附能力。

3.3 其他低豐度肽的分離方法

除了磷酸肽及糖肽，生物體內(nèi)還有多種與生物體代謝及與生理活動(dòng)密切相關(guān)的內(nèi)源性功能肽。研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化在自身免疫性疾病類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[109]。在較低pH值下，瓜氨酸側(cè)鏈脲基只與乙二醛發(fā)生反應(yīng)[110]。Tutturen等[111]選擇親水性丙烯酰胺基珠（肌氨酸二甲基丙烯酰胺樹(shù)脂）作為反應(yīng)珠，將乙二醇衍生物固定在反應(yīng)珠上，合成了特異性富集瓜氨酸的納米材料，成功用于富集混有合成瓜氨酸肽（50 pmol）的胰蛋白酶牛血清白蛋白消化液（50 pmol）。

Palani等[112]合成了具有超順磁性的Fe3O4@SiO2納米材料，并在其表面修飾巰基官能團(tuán)，從而特異性吸附半胱氨酰肽，去除其他復(fù)雜蛋白質(zhì)組分的影響，快速富集半胱氨酰肽。Saraji等[113]制備了酰肼功能化磁性納米粒子快速吸附N-末端絲氨酸和蘇氨酸肽；吸附前，首先將目標(biāo)肽中1,2-氨基醇的羥基氧化為醛基，然后將醛基與酰肼功能化磁性納米粒子進(jìn)行特異性結(jié)合。

此外，對(duì)于普遍內(nèi)源性功能肽的富集，Z h a n g Quanqing等[114]合成了有序介孔二氧化硅-碳材料，碳和石墨烯的獨(dú)特疏水性確保了肽富集的高效率，能夠從20 μL人血清中富集892 種內(nèi)源性功能肽（使用石墨烯@mSiO2，僅富集到344 種）。Yao Ning等[115]依據(jù)材料與肽間的疏水作用，利用氯二甲基辛基硅烷改性胺功能化磁性顆粒，制備了C8功能化磁性顆粒（約50 nm）；與廣泛運(yùn)用的商業(yè)化C8功能化磁珠（1～10 μm）相比，它具有更加優(yōu)異的磁性及更好的分散性，在人血清樣本中，只需要富集約30 s，就可以鑒定出內(nèi)源性功能肽。

納米材料與色譜法聯(lián)用富集內(nèi)源性功能肽，能夠去除復(fù)雜成分和高豐度蛋白的影響，并且能定向提取某種肽類(lèi)。其已經(jīng)成功應(yīng)用于人血清、小鼠大腦提取物及人體其他體液中內(nèi)源性功能肽的富集，但是納米材料不適用于大量的生物分析，且納米材料也不易與樣品分離，造成目標(biāo)肽污染。因此，需要研制出更加快速、高效、易于分離的新型納米材料。

4 結(jié) 語(yǔ)

功能性肽可以用于功能性食品開(kāi)發(fā)、疾病檢測(cè)、美容用品研發(fā)等領(lǐng)域，具有極大的開(kāi)發(fā)利用潛力。然而因其制備產(chǎn)物成分復(fù)雜或其本身含量極低，影響了分離和富集效果，制約了其功能的開(kāi)發(fā)和利用。

關(guān)于外源性功能肽的分離純化，目前所使用的各種分離手段存在不足之處。近年來(lái)，肽分離純化的發(fā)展趨勢(shì)是多種方法聯(lián)用。盡管多種方法聯(lián)用能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、分級(jí)分離，從而獲得高純的肽組分并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，但是過(guò)程繁瑣復(fù)雜、回收率低，對(duì)于特定功能的肽分離，效果并不理想。因此尋找更高效、快速的肽分離方法，將為肽的功能性研究和利用帶來(lái)更廣闊的發(fā)展空間。

關(guān)于低豐度內(nèi)源性功能肽的富集，如何高效去除高豐度蛋白的影響、提高內(nèi)源性功能肽的富集效率和回收率、實(shí)現(xiàn)大規(guī)模鑒定是方法成功的關(guān)鍵。介孔材料通過(guò)體積排阻效應(yīng)可以有效去除高豐度蛋白，表面修飾的特定基團(tuán)能夠快速高效富集肽，因此，表面功能化的介孔材料能夠選擇性吸附具有特定結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性功能肽，具有良好的發(fā)展前景。

功能性肽的深入研究與人類(lèi)健康息息相關(guān)，其分離與富集技術(shù)的優(yōu)化能夠促進(jìn)食品、藥品等行業(yè)的快速發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)需要借助其他領(lǐng)域的新材料、新方法，發(fā)展出便捷、高效、覆蓋面廣的分離和富集方法，才能更便捷、更高效地得到功能性肽，為國(guó)民健康奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。