食品中微生物間交互模型的研究進展

張文敏，方太松，王 翔，耿方琳，劉 箐，董慶利,

（1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.陜西中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，陜西 咸陽 712000）

食品安全問題與人們的生活息息相關(guān)，其中由微生物導(dǎo)致的食品腐敗和食源性疾病問題不容忽視[1]。食品預(yù)測微生物學可運用數(shù)學模型描述食品在流通過程中環(huán)境因素對微生物生長、殘存和死亡動態(tài)的影響[2]。數(shù)學模型是食品預(yù)測微生物學研究的核心，基于預(yù)測模型得到的腐敗菌生長情況可用于預(yù)測食品的貨架期[3]， 得到的食源性致病菌生長數(shù)據(jù)是微生物暴露評估不可缺少的部分[4]。數(shù)學模型的正確選擇對準確預(yù)測微生物的生長動態(tài)至關(guān)重要。構(gòu)建正確的微生物生長模型可以給食品安全決策者提供更為精確的微生物生長信息，對于保障食品質(zhì)量和食品安全具有十分重要的意義。

自20世紀以來，預(yù)測微生物學專家們探究并引入多種數(shù)學模型到食品預(yù)測微生物學領(lǐng)域中，隨之出現(xiàn)了多種模型分類方法[5-6]。另外，快速高效并且省時省力的分子生物學技術(shù)，如實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qPCR）、DNA雜交探針和變性梯度凝膠電泳技術(shù)，也被引進食品預(yù)測微生物學領(lǐng)域，用來監(jiān)測微生物的生長、殘存和死亡信息[7]。然而，無論是新數(shù)學模型的提出還是微生物監(jiān)測方法的改進，大多數(shù)研究只局限于探究單一微生物在純培養(yǎng)或消除本底菌的食品中的生長繁殖特點，這明顯不符合實際食品中多種微生物共存的情況。并且傳統(tǒng)預(yù)測模型建立的條件之一是假設(shè)微生物的生長環(huán)境（如溫度、pH值、水分活度）在微生物整個生存期間保持不變，這與微生物在實際食品環(huán)境中的生長與存活情況差別較大。

自1990年以來，食品預(yù)測微生物學發(fā)展的主要方向之一是關(guān)注微生物在實際食品環(huán)境的生長動態(tài)[8-9]。實際食品基質(zhì)中多種微生物共同存在，“微生物-微生物”及“微生物-環(huán)境”之間均存在著相互作用。這些相互作用包括相互抑制、互不影響和相互促進3 種關(guān)系。Ye Keping等[10]的研究發(fā)現(xiàn)在真空冷卻包裝的豬肉中，腐敗菌之一的乳桿菌（Lactobacillusspp.）可抑制單增李斯特菌的生長。Ye等[11]的另一項研究發(fā)現(xiàn)冷卻生豬肉中，背景菌的存在對單增李斯特菌的生長沒有明顯影響。Ginovart等[12]發(fā)現(xiàn)酸奶中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）可產(chǎn)生甲酸鹽和CO2氣體，這些產(chǎn)物可促進保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）的生長；同時保加利亞乳桿菌也可產(chǎn)生一些蛋白酶促進嗜熱鏈球菌的生長。因此，在構(gòu)建微生物預(yù)測模型時，需要考慮微生物生長的實際環(huán)境。近年來，預(yù)測微生物學專家們已將微生物間交互模型引入到食品預(yù)測微生物學領(lǐng)域，包括不考慮微生物相互作用機制的描述性數(shù)學模型和考慮微生物相互作用機制的機械型交互模型。

本文首先簡要介紹了傳統(tǒng)的預(yù)測微生物數(shù)學模型，然后闡述了實際食品系統(tǒng)中微生物與環(huán)境之間的交互作用現(xiàn)象，介紹了描述性和機械性兩類微生物間交互模型，并且分析了這兩類模型的推導(dǎo)過程，最后對食品中微生物間交互模型的應(yīng)用前景進行了展望，以期為預(yù)測微生物學的相關(guān)研究提供參考。

1 傳統(tǒng)的預(yù)測微生物數(shù)學模型

1.1 傳統(tǒng)的數(shù)學模型分類

1922年，Esty等[13]首先應(yīng)用數(shù)學模型構(gòu)建了肉毒梭菌（Clostridium botulinum）在加熱作用下的失活模型。1922年—1983年是預(yù)測微生物學處于緩慢平穩(wěn)的發(fā)展時期。1983年，Roberts等[14]正式提出將“食品預(yù)測微生物學”作為一門學科。同時，得益于計算機技術(shù)的發(fā)展，預(yù)測微生物學專家們將多種數(shù)學模型引入到食品預(yù)測微生物學領(lǐng)域，并按不同的方法進行分類[15]。

預(yù)測微生物模型分類方式有以下幾種：生長模型和失活模型、概率模型和確定性模型、經(jīng)驗?zāi)Ｐ秃蜋C理模型。目前被廣為接受的是Buchanan等[16]基于變量的不同將預(yù)測微生物模型分為一級模型、二級模型和三級模型的方法。一級模型描述微生物數(shù)量變化（生長或死亡）和時間的關(guān)系；二級模型描述一級模型中的微生物動力學參數(shù)和環(huán)境參數(shù)（如溫度、水分活度、添加劑、pH值及氣體包裝條件）的關(guān)系；三級模型是在一級模型和二級模型的基礎(chǔ)上通過計算機編程得到的軟件，它使得非專業(yè)人士可以快速準確地獲得預(yù)測微生物學相關(guān)信息。目前，傳統(tǒng)預(yù)測微生物學的模型構(gòu)建方法以及食品預(yù)測微生物學軟件都已經(jīng)比較完善（表1）。

表 1 主要的預(yù)測微生物生長模型及軟件平臺Table 1 Major PFM growth models and software platforms

1.2 傳統(tǒng)的數(shù)學模型建模方法

預(yù)測微生物學成立的前提是微生物種群對環(huán)境條件的反應(yīng)是可重現(xiàn)的。預(yù)測微生物學的核心在于建立正確的數(shù)學模型，然后利用已建立的數(shù)學模型預(yù)測在特定環(huán)境下微生物未來的生長和死亡動態(tài)。一級模型種類很多（表1），表達式也較復(fù)雜，但模型的實質(zhì)是一元函數(shù)Nt＝f（t，μ，λ，a，b，c…），其中因變量Nt是菌落濃度的對數(shù)（lg（CFU/g）或者ln（CFU/g），下文中均用lg（CFU/g）），自變量t是時間/h。參數(shù)μ是微生物生長的比生長速率/（lg（CFU/g））－h(huán)、λ是遲滯時間/h，a、b和c等字母代表其他參數(shù)。二級模型是構(gòu)建一級模型中的微生物生長動力學參數(shù)和環(huán)境參數(shù)的函數(shù)關(guān)系。不同溫度（T）條件下，傳統(tǒng)的預(yù)測微生物建模過程見圖1。

圖 1 不同溫度條件下單一純菌生長模型的構(gòu)建Fig. 1 Development of pure bacterial growth models at different temperatures

2 食品中微生物間交互模型

2.1 食品中微生物間交互作用

實際食品環(huán)境是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，多種微生物共存于同一個食品基質(zhì)。食品中“微生物-微生物”之間相互影響的關(guān)系見圖2。微生物生長的“環(huán)境”包括食品基質(zhì)的物化環(huán)境和食品中微生物之間的相互作用。在食品基質(zhì)中，食品的環(huán)境會影響微生物的生長繁殖。同樣地，微生物生長繁殖消耗掉大部分營養(yǎng)物質(zhì)以及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以改變食品環(huán)境。另外，微生物與微生物之間也存在著協(xié)同或者拮抗作用。假如細菌N1以μ1的速率生長繁殖，細菌N2以μ2的速率生長繁殖（圖2），如果其中一種細菌產(chǎn)生了促進細菌生長的物質(zhì)，使得細菌N1和N2形成互相促進生長的協(xié)同作用，那么μ1和μ2的值就會增加；如果其中一種細菌產(chǎn)生了抑制細菌生長的物質(zhì)，那么μ1和μ2的值就會減小。食品環(huán)境和其他微生物的存在對所要研究的微生物生長都可能產(chǎn)生影響；因此，構(gòu)建微生物在食品中的生長模型時，需要考慮微生物實際生存的環(huán)境。

圖 2 食品生態(tài)系統(tǒng)中微生物間交互作用圖解[24]Fig. 2 Schematic representation of interactions between microorganisms in a food ecosystem[24]

Jameson[25]于1962年首先發(fā)現(xiàn)微生物之間存在交互作用。20世紀末，很多學者發(fā)現(xiàn)處于同一環(huán)境中的微生物，若其中一種優(yōu)勢微生物達到最大菌落濃度，另一種微生物的生長會受到影響，可能失活、停止生長或者以減小的速度繼續(xù)生長。2000年，Ross等[26]正式將這種現(xiàn)象稱作Jameson-effect理論。之后，很多學者開始關(guān)注微生物之間的交互效應(yīng)，例如煙熏魚中單增李斯特菌和腐敗菌的交互作用[27]、牛奶中發(fā)酵劑對金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用[28]及豬肉中單增李斯特菌和假單胞菌[29]的競爭生長作用。

另外，處于食物鏈中同一位置的動物之間存在著競爭食物的關(guān)系，這種現(xiàn)象可用Lotkae-Volterra效應(yīng)描述。Dens等[30]于2003年將Lotkae-Volterra模型引入到預(yù)測微生物學領(lǐng)域描述微生物之間的交互作用。Lotkae-Volterra模型建立的理論基礎(chǔ)是：消耗同一種營養(yǎng)物質(zhì)的兩種微生物之間存在著交互作用，當營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，兩種微生物同時停止生長。Vimont等[31]用Lotkae-Volterra模型構(gòu)建了大腸桿菌和背景菌在牛肉中的生長模型。Giuffrida等[32]研究了單增李斯特菌在意大利香腸中的生長情況。Mounier等[33]研究了奶酪中“酵母菌-酵母菌”及“酵母菌-微生物”之間的交互作用。

2.2 食品中微生物間交互模型

微生物之間的交互作用有3 種：相互促進、互不影響或者相互抑制作用。目前發(fā)現(xiàn)最多的是食品基質(zhì)中存在著優(yōu)勢菌群抑制弱勢菌群的現(xiàn)象[34-37]。例如在發(fā)酵香腸中乳酸菌快速生長繁殖，抑制了大腸桿菌和單增李斯特菌的生長[38]。乳酸菌對其他微生物的抑制作用可能是由于抑菌代謝產(chǎn)物如乳酸、細菌素和CO2等的產(chǎn)生，還可能是微生物之間的營養(yǎng)競爭和細胞接觸[39-41]作用。預(yù)測微生物學家已經(jīng)注意到微生物間的相互作用會改變微生物的生長形式，用傳統(tǒng)的預(yù)測微生物模型描述微生物的生長已經(jīng)不太合適。近些年來，兩菌交互模型如描述性模型和機械性模型已經(jīng)被引入到預(yù)測微生物學領(lǐng)域（表2）。

表 2 應(yīng)用交互模型描述微生物生長動態(tài)Table 2 Application of interaction models to describe microbial growth

2.2.1 描述性微生物間交互模型

不同于傳統(tǒng)的預(yù)測微生物模型，在交互模型中，每一個時間點（ti）對應(yīng)著兩種微生物的菌落濃度（N1i和N2i），微生物間交互模型的建立過程如圖3所示。描述性交互模型不考慮微生物間交互作用的機制，直接將微生物菌落濃度作為一個抑制條件，用簡單的數(shù)學模型量化其他微生物對目標微生物生長的影響。描述性交互模型主要包括Jameson-effect模型和Lotkae-Volterra模型，這兩種模型是基于傳統(tǒng)的Baranyi模型和Buchanan三階段線性模型擴展而來的。不同溫度條件下，微生物間建模過程如圖3所示。

圖 3 不同溫度條件下微生物間交互模型的構(gòu)建Fig. 3 Development of microbial interaction models at different temperatures

為了進一步了解傳統(tǒng)一級模型和一級交互模型之間的關(guān)系，現(xiàn)將Jameson-Baranyi模型、Jameson-Buchanan模型和Lotkae-Volterra模型公式進行推導(dǎo)，具體如下。

微生物生長模型的一般形式見公式（1）[8]。

式中：α（t）是調(diào)整函數(shù)；f（t）是抑制函數(shù)；μmax是微生物的最大比生長速率。

根據(jù)微生物自身生理特性不同，兩菌有不同的調(diào)整函數(shù)；因為兩菌在一個食品基質(zhì)中，它們具有同一個抑制函數(shù)，所以描述性交互模型的一般形式如式（2）所示。

在Baranyi模型中，適應(yīng)函數(shù)和抑制函數(shù)分別見 式（3）、（4）。

式中：q是微生物的生理狀態(tài)λ是遲滯期。

在Buchanan三階段模型中[16]，適應(yīng)函數(shù)和抑制函數(shù)分別見式（5）、（6）。

式中：tmax是微生物達到最大菌落濃度所需的時間。

在Lotkae-Volterra模型中，適應(yīng)函數(shù)αA（t）同 式（3），抑制函數(shù)[51]見式（7）。

因此Jameson-Baranyi模型見式（8）。

Jameson-Buchanan模型見式（9），其中tmax是優(yōu)勢微生物達到最大菌落濃度的時間。

Lotkae-Volterra模型見式（10）。

式中：αAB和αBA反映了兩個微生物種群的交互情況。當αAB（αBA）＞1時，說明微生物B（A）達到最大菌落濃度后，微生物A（B）濃度減少；當αAB（αBA）＝1時，說明微生物B（A）和A（B）無相互作用。當αAB（αBA）＜1 時，說明微生物B（A）達到最大菌落濃度后，微生 物A（B）濃度增加。

Jameson-effect模型的成立是基于“同一系統(tǒng)中兩種細菌生長過程中的減速是同時進行”這一假設(shè)的，這個假設(shè)非常簡單，因此，Jameson-effect模型的形式也不復(fù)雜[10]。但是這一假設(shè)并不一定適用于所有微生物之間的交互情況，因此在擬合過程中效果并不是很好。如Ye Keping等[10]在研究豬肉中乳桿菌對單增李斯特菌的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，乳桿菌Nmax的預(yù)測值比實測值低。可根據(jù)細菌的實際生長情況對Jameson-effect模型進行改良，以提高其擬合優(yōu)度。Le Marc等[52]在研究牛奶中乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用時發(fā)現(xiàn)，乳酸菌達到最大菌落濃度前，金黃色葡萄球菌停止了生長，因此在模型中增加了一個“關(guān)鍵細胞濃度”的參數(shù)（小于最大細胞濃度）；且發(fā)現(xiàn)修正后的模型更適用于描述乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用，修正后的模型說明金黃色葡萄球菌比乳酸菌對營養(yǎng)限制或者代謝產(chǎn)物更加敏感。Mejlholm等[37]在研究蛋黃醬海鮮沙拉中乳桿菌對單增李斯特菌的抑制作用時，在抑制函數(shù)中加了一個抑制系數(shù)“γ”，若γ＜1，說明在乳桿菌停止生長時，單增李斯特菌濃度繼續(xù)增加；若γ＞1，表示單增李斯特菌濃度減??；若γ＝1，表示單增李斯特菌停止生長。這種改良形式的Jameson-effect模型能夠很好地描述兩種微生物之間的交互作用。

Lotkae-Volterra模型含有兩個參數(shù)αAB和αBA，因此解微分方程的過程比較復(fù)雜。并且有研究表明Lotkae-Volterra模型能夠高估細菌的遲滯期時間，低估生長速率，這種預(yù)測結(jié)果是“失敗-危險”的[10]，因此Lotkae-Volterra模型不適宜直接作為一級交互模型來模擬兩種細菌的交互作用。但是Lotkae-Volterra模型中參數(shù)αAB和αBA反映了兩個微生物種群的交互情況，可以用來評估處于同一生態(tài)系統(tǒng)中的兩種細菌是否具有相互作用，進而再進行后續(xù)研究。還有研究將Lotkae-Volterra模型改良后作為三級模型，用來描述環(huán)境因子對細菌競爭作用程度的影響[53]。

2.2.2 機械性模型

機械性模型將微生物整個生長過程中環(huán)境條件的動態(tài)變化及微生物之間的交互機制考慮進去，比如微生物生長過程中食品環(huán)境p H 值的變化和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗等。微生物生長模型的一般形式為：Bernaerts等[24]認為，在整個食品基質(zhì)中，n種微生物共同生長時符合公 式（11）所示的規(guī)律。

由式（11）可知，μi的大小受到環(huán)境中微生物菌種（i，j,…，i≠j）、環(huán)境因素（env）、代謝物（M）、營養(yǎng)物質(zhì)（S）及物理狀態(tài)（phys）等各種因素影響。根據(jù)具體環(huán)境分析微生物的生長受到哪些因素影響，當μmax＞0時，說明微生物在生長，當μmax＜0時，說明微生物處于失活情況。

在機械性模型中，由某一種環(huán)境參數(shù)“x”引起微生物“i”的變化可用式（12）[18]表示。

式中：μiopt（x）是不存在抑制因子時，微生物的最優(yōu)比生長速率。當γ＝1時，說明微生物的生長不受抑制；當γ＝0時，說明微生物的生長完全受到抑制。另外，環(huán)境“x”一般隨時間一直變化。

以環(huán)境pH值的變化以及微生物營養(yǎng)競爭為例介紹機械性模型的使用方法。Martens等[42]在研究彎曲乳桿菌對陰溝腸桿菌的影響時，考慮到了彎曲乳桿菌會產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，進而影響環(huán)境的pH值，他在描述環(huán)境中pH值的變化時用到了式（13）。

式中：pHopt、pHmin和pHmax分別是適合微生物生長的最優(yōu)pH值、最小pH值和最大pH值。

Martens等[42]還考慮到了微生物之間的營養(yǎng)競爭作用，他認為營養(yǎng)消耗的規(guī)律符合莫納德生長動力學 （式（14））。

式中：S是營養(yǎng)物質(zhì)水平；KS是莫納德常數(shù)。

當然，還可能是其他環(huán)境參數(shù)的變化影響了微生物的生長。根據(jù)“γ概念”，如果微生物的生長受到多種環(huán)境因素的抑制，可將γ函數(shù)相乘（如式（13）和 式（14））[54-55]。Leroy等[43]根據(jù)“γ概念”構(gòu)建了清酒乳桿菌CTC 494菌株在生長過程中通過消耗葡萄糖、產(chǎn)生乳酸及產(chǎn)生細菌素來抑制單增李斯特菌的模型。Martens等[42]計算出了彎曲乳桿菌和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）的交互作用開始時間。另外，Couvert等[56]研究了CO2、溫度及pH值對單增李斯特菌和熒光假單胞菌生長能力的影響，發(fā)現(xiàn)CO2氣體能夠溶解于水中改變“環(huán)境”，進而影響致病菌的生長。Poschet等[57]也用這種辦法構(gòu)建了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和英諾克李斯特菌（Listeria innocua）的共同生長模型。機械性交互模型可將影響微生物生長的每一個因素都考慮進去，能夠很好地描述微生物間交互影響的過程，但是模型建立的過程比較復(fù)雜，需要極強的數(shù)學與計算機能力。

3 結(jié) 語

食品預(yù)測微生物學的主要目的是運用數(shù)學模型對微生物的生長進行定量分析，可幫助人們在沒有進行微生物檢測的前提下，預(yù)測微生物的生長和死亡，為食品安全提供重要保障。食品預(yù)測微生物學在食品貨架期、食品安全的預(yù)測和管理中有很大的應(yīng)用價值。構(gòu)建正確的數(shù)學模型可為食品安全決策者提供準確的微生物信息。微生物在食品中絕不是單獨存在的，預(yù)測微生物學未來的發(fā)展方向必將是模擬微生物在實際食品中的生長情況。近些年，預(yù)測微生物學家已將微生物間交互模型引入到食品預(yù)測微生物學中。本文介紹了微生物間交互模型的理論基礎(chǔ)，并且分析了微生物間交互模型的推導(dǎo)過程，為今后微生物間交互模型的相關(guān)研究提供參考。盡管已有較多文獻研究微生物間交互模型，但要使得微生物間交互模型服務(wù)于食品安全控制還有很多工作需要完善，對微生物間交互模型未來的研究方向展望如下： 1）目前微生物間交互模型還多集中于兩種微生物之間的相互作用，但是實際食品中肯定是多種微生物共存的，研究多種微生物之間的相互作用更具有實際意義；2）已有的食品貨架期預(yù)測模型和微生物暴露評估研究中用到的數(shù)學模型大多還是單一菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下的數(shù)學模型，要準確預(yù)測微生物的生長情況，還需將兩種甚至多種細菌之間的交互模型實際應(yīng)用到食品質(zhì)量和食品安全控制中；3）當多種微生物共存時，傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法可能無法將微生物分離開來，因此需要將分子生物學方法如qPCR技術(shù)和DNA雜交探針技術(shù)等引入到預(yù)測微生物學中；4）實際食品中微生物的菌落濃度較低，因此構(gòu)建單細胞水平下的微生物間交互模型更具有實際意義；5）微生物間交互模型的數(shù)學形式比較復(fù)雜，模型建立的過程也比較繁瑣，因此可將微生物間交互模型結(jié)合到已有的微生物預(yù)測軟件中，使得非專業(yè)人士也可以快速準確地獲得預(yù)測微生物學相關(guān)信息的指導(dǎo)，為數(shù)據(jù)分析奠定工作基礎(chǔ)。