氟比洛芬酯減輕大鼠心肌缺血的作用及機(jī)制研究

王懷洲，姜志紅，姚美令

(煙臺(tái)市口腔醫(yī)院 1.手術(shù)麻醉科;2.老年口腔科;3.檢驗(yàn)科,山東 煙臺(tái)264008)

非甾體類抗炎藥(NSAIDS)具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等藥理作用，臨床上應(yīng)用廣泛[1]。NSAIDS通過抑制環(huán)氧合酶(COX)，進(jìn)而阻斷其催化花生四烯酸(AA) 而生成前列腺素(PG)，抑制致痛物質(zhì)及炎性介質(zhì)合成，阻斷受損部位的痛覺向脊髓傳導(dǎo)。氟比洛芬酯是一種新型丙酸類NSAIDS，是新一代環(huán)氧合酶(COX) 抑制劑，以脂微球?yàn)樗幬镙d體，常用于術(shù)后疼痛和癌癥疼痛的治療[2,3]。

氟比洛芬酯注射液由于脂微球包裹，使其具有較強(qiáng)的靶向性，可將包裹的藥物運(yùn)送到發(fā)病部位發(fā)揮療效；脂微球包裹還可以控制藥物釋放，使藥物作用時(shí)間延長，減少藥物用量，降低不良反應(yīng)發(fā)生率；脂微球還使藥物易于跨越細(xì)胞膜，加快藥物吸收，縮短起效時(shí)間[4]。氟比洛芬酯注射液具有靶向性的機(jī)制可能是腫瘤及手術(shù)創(chuàng)口處血管內(nèi)壁粗糙，炎性介質(zhì)大量合成，炎性病變導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間隙擴(kuò)大，使氟比洛芬在炎癥部位聚集[5]。

有研究表明，NSAIDS具有潛在不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，但其對心肌缺血所致細(xì)胞損傷作用目前仍未引起足夠關(guān)注[6]。氟比洛芬酯在臨床上主要用于術(shù)后疼痛和癌癥疼痛的治療，在其應(yīng)用過程中，如果發(fā)生心肌缺血，其對心肌損傷的影響尚無研究報(bào)道。本研究通過制備心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停瑧?yīng)用不同劑量氟比洛芬酯，觀察其對心肌缺血損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

48只健康雄性Wistar大鼠，體重250-320 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。合格證編號SCXK(魯)2014-0007。隨機(jī)分為4組，每組12只：對照組(CON組)、異丙腎上腺素組(ISO組)、氟比洛芬酯(5 mg/kg)組(FA-L組)、氟比洛芬酯(10 mg/kg)組(FA-H組)。

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境1周,室內(nèi)溫度25±2 ℃,濕度(50±10)%,12 h晝夜交替,自由飲食,避免不良刺激。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,不禁水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

氟比洛芬酯(北京泰德制藥股份有限公司，批號：3E1988)，異丙腎上腺素(sigma公司，批號：017K1402)，乳酸脫氫酶(LDH，南京建成生物工程研究所，批號：20180529)，肌酸激酶同工酶(CK-MB，南京建成生物工程研究所，批號：20180418)，肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI，南京建成生物工程研究所，批號：20180526)，TNF-α試劑盒(Cusabio biotech有限公司，批號：M17044806)，IL-1β試劑盒(Cusabio biotech有限公司，批號：M26185903)，IL-6 試劑盒(Abcam公司，批號：ab100772)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材

電熱恒溫水浴箱(常州國華電器有限公司，型號；HH-60)；光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(Olympus公司，型號：CX31-32C02)；電子分析天平(上海寺岡電子有限公司，型號：DS-671)；酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司，型號：Synexgy HT)；臺(tái)式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用激光儀器廠，型號：TGL-16G)

1.4 動(dòng)物模型制備及給藥

除CON組外其余各組大鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(20 mg/kg)，1次/天，連續(xù)注射3天制備心肌缺血模型，CON組皮下注射等體積的生理鹽水。注射鹽酸異丙腎上腺素30 min后氟比洛芬酯組大鼠尾靜脈注射相應(yīng)劑量藥物。

1.5 cTnI含量及CK-MB、LDH活力檢測

末次給藥2 h后異氟烷麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置2 h后3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃保存待測。按試劑盒說明書檢測cTnI、CK-MB、LDH。

1.6 心肌病理組織學(xué)

每組隨機(jī)取3只大鼠，取血后開胸，取出心臟，冰生理鹽水沖洗，去除大血管、結(jié)締組織，濾紙吸干。放入10%甲醛中固定，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 IL-1β、TNF-α、IL-6水平

取大鼠左心室心肌組織，冰生理鹽水沖洗，濾紙拭干。分析天平稱重后置于試管中，加入重量為組織重量4倍的4℃生理鹽水，勻漿(4 000 r/min，20 s)，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液按試劑盒說明書檢測大鼠心肌組織蛋白含量，TNF-α、IL-1β及IL-6水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氟比洛芬酯對cTnI、CK-MB、LDH的影響

與CON組比較，ISO組大鼠血清cTnI、CK-MB、LDH明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與ISO組相比，氟比洛芬酯組大鼠血清cTnI、CK-MB、LDH顯著降低(P<0.01)，(圖1、圖2、圖3)。

圖1 氟比洛芬酯對cTnI的影響

圖2 氟比洛芬酯對CK-MB的影響

圖3 氟比洛芬酯對LDH的影響

2.2 氟比洛芬酯對心肌病理變化的影響

CON組大鼠心肌細(xì)胞紋理清晰，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞間無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤；ISO組大鼠心肌結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維斷裂，有局灶性壞死及空泡變性，細(xì)胞間隙明顯水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤。氟比洛芬組大鼠心肌病理損傷減輕，多數(shù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，炎癥細(xì)胞浸潤減少，水腫程度減輕(圖4)。

圖4 氟比洛芬酯對心肌損傷的影響(×400，n=3)

2.3 氟比洛芬酯對心肌組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影響

與CON組比較，ISO組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β及IL-6含量明顯升高(P<0.05)；與ISO組相比，氟比洛芬酯組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β及IL-6 含量顯著降低(P<0.01)(圖5、圖6、圖7)。

圖5 氟比洛芬酯對心肌組織TNF-α含量的影響

圖6 氟比洛芬酯對心肌組織IL-1β含量的影響

3 討論

肌鈣蛋白是存在于骨胳肌、心肌和平滑肌細(xì)胞內(nèi)與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì),cTnI與鈣結(jié)合后參與肌肉收縮過程。cTnI對心肌損傷具有高度特異性和靈敏性，是心肌受損的重要血清標(biāo)志物。cTnI在未發(fā)生心肌損傷的人群血清中通常檢測不到或含量很低,而發(fā)生心肌損傷時(shí)，血清cTnI水平增高，且cTnI增高水平與心肌損傷及壞死程度呈正相關(guān),cTnI是診斷心肌損傷或心肌梗死的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。

圖7 氟比洛芬酯對心肌組織IL-6含量的影響

心肌酶是臨床上評價(jià)冠心病病人心肌損傷的常用指標(biāo)，心肌酶水平升高可反映患者病情嚴(yán)重程度。LDH分子量小，心肌受損后周血中LDH水平可顯著增高，并且LDH增高持續(xù)時(shí)間長。CK-MB在心肌損傷4 h內(nèi)開始升高，16-24 h達(dá)峰值。

本研究結(jié)果表明：與ISO組相比，氟比洛芬酯可以顯著降低血清中cTnI含量，但不同劑量氟比洛芬酯組對cTnI含量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。氟比洛芬酯組大鼠血清中LDH和CK-MB水平也較ISO組大鼠明顯降低，提示氟比洛芬酯在心肌缺血過程中能夠減輕心肌損傷程度。

心肌病理檢查顯示：CON組心肌細(xì)胞紋理清晰，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。而ISO組大鼠心肌結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維斷裂，局灶性壞死及空泡變性，水腫和炎性細(xì)胞浸潤。應(yīng)用氟比洛芬酯后，大鼠多數(shù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，炎癥細(xì)胞浸潤減少，水腫程度減輕。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)氟比洛芬酯能夠減輕缺血所致心肌損傷。

張穎等臨床研究發(fā)現(xiàn)，心臟瓣膜置換術(shù)中應(yīng)用FA(1、2 mg/kg)可抑制TNF-α、IL-6釋放，減輕炎癥反應(yīng)[7]。那么，氟比洛芬酯抗心肌缺血作用是否與抗炎有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)檢測了心肌組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CON組比較，ISO組IL-1β、TNF-α、IL-6水平增高。但應(yīng)用氟比洛芬酯(5，10 mg/kg)后，心肌缺血模型大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著降低。這表明氟比洛芬酯減輕缺血所致心肌損傷的機(jī)制與其抗炎作用有關(guān)。

Sun等發(fā)現(xiàn)再灌注24小時(shí)后，氟比洛芬酯組炎癥介質(zhì)TNF-α,IL-6 and IL-1β比對照組明顯升高[8]。孫亮等認(rèn)為FA可作為心肌細(xì)胞鈉通道失活的穩(wěn)定劑，發(fā)揮一定的抗心律失常作用。鑒于FA 對鈉通道的影響，如果在心肌缺血再灌注損傷期間給予一定量的FA 可能會(huì)避免細(xì)胞離子和能量失衡，從而起到一定程度的抗心律失常和減輕心肌損傷的作用[9]。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中并沒有觀察氟比洛芬酯是否能夠改善心肌缺血大鼠心律失常從而減輕心肌缺血損傷，這是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一個(gè)缺陷。

氟比洛芬酯具有減輕心肌缺血損傷作用，其作用機(jī)制與氟比洛芬酯抑制炎癥因子產(chǎn)生從而減輕心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。