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    產(chǎn)酸克雷伯菌新生兒分離株對碳青霉烯類耐藥的分子機(jī)制

    2020-02-07 08:35:18李篤軍馮漸燾劉真真劉入華陳海霞朱元祺
    關(guān)鍵詞:核酸酶產(chǎn)酸凝膠電泳

    李篤軍,馮漸燾,劉真真,劉入華,賈 楠,陳海霞,趙 輝,朱元祺*

    (1.煙臺業(yè)達(dá)醫(yī)院 檢驗(yàn)科,山東 煙臺264006;2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,山東 青島266555;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島266071)

    目前,無論是國內(nèi)還是國外耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù),都顯示對碳青酶烯類耐藥的腸桿菌以克雷伯菌屬為主[1,8]。其中,克雷伯菌屬中又以肺炎克雷伯菌居多,而產(chǎn)酸克雷伯菌報(bào)道相對較少。與肺炎克雷伯菌一樣,產(chǎn)酸克雷伯菌可引起人體的呼吸、血流、腹腔和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染[1,2]。因此,我們對2013年9月-2013年12月分離自新生兒患者的3株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機(jī)制和菌株間的同源性進(jìn)行研究,為臨床治療和采取感控措施提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株3株碳青霉烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌(TJ11-TJ13)是2013年9月-2013年12月分離自新生兒患者的吸痰液。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324和大腸埃希菌ATCC25922及接合試驗(yàn)受體菌EscherichiacoliJ53AziR為本室保存。臨床株的鑒定和藥敏使用VITEK 2 Compact系統(tǒng),藥敏依據(jù)CLSI-2018標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[3]。醫(yī)院感染的診斷依據(jù)患兒的臨床資料和 “醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(2001年試行)[4]進(jìn)行。

    1.2 設(shè)備與試劑PCR擴(kuò)增儀和脈沖場電泳儀為美國伯樂公司;脈沖場凝膠電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)為英格蘭Biolabs公司;DNA的地高辛標(biāo)記試劑為羅氏公司;其他試劑和材料為大連寶生(TaKaRa)生物。

    1.3 耐藥基因的擴(kuò)增依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]方法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶及其他耐藥相關(guān)基因,并通過產(chǎn)物測序確定基因型。生工生物(上海)工程有限公司完成引物合成和產(chǎn)物測序。

    1.4 脈沖場凝膠電泳和多位點(diǎn)序列分型脈沖場凝膠電泳(PFGE)依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)操作,結(jié)果判斷依據(jù)Tenover規(guī)則[6]。多位點(diǎn)序列分型(MLST)參照產(chǎn)酸克雷伯菌網(wǎng)站提供管家基因的引物序列和反應(yīng)條件進(jìn)行 (https://pubmlst.org/koxytoca)。

    1.5 質(zhì)粒接合和分型供體菌(產(chǎn)酸克雷伯菌)與受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)接合試驗(yàn)和質(zhì)粒復(fù)制子分型(PBRT )按相關(guān)文獻(xiàn)操作[5]。

    1.6 S1核酸酶切質(zhì)粒和Southern雜交S1核酸酶酶切質(zhì)粒的脈沖場凝膠電泳和Southern雜交實(shí)驗(yàn)按以前文獻(xiàn)報(bào)道的方法[5]。

    2 結(jié)果

    2.1 產(chǎn)酸克雷伯菌和接合子的藥敏及耐藥基因結(jié)果

    菌株藥敏顯示這3株產(chǎn)酸克雷伯菌除了對氨基糖苷類、喹諾酮類和氨曲南敏感外,對測試的β-內(nèi)酰胺類抗生素都耐藥。另外,供體菌(產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11-TJ13)與受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)經(jīng)液相接合獲得了接合子(TJC11-TJC13)。PCR擴(kuò)增和測序表明產(chǎn)酸克雷伯菌與其接合子都攜帶blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因,且二者顯示相似的耐藥表型。但是,接合子(TJC11-TJC13)比受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)對β-內(nèi)酰胺類抗生素明顯耐藥。詳見表1-表2。

    表1 產(chǎn)酸克雷伯菌臨床株、接合子和受體菌的藥敏(μg/mL)

    表2 產(chǎn)酸克雷伯菌與其接合子攜帶的耐藥基因和接合子的質(zhì)粒分型

    2.2 產(chǎn)酸克雷伯菌的脈沖場凝膠電泳和多位點(diǎn)序列分型結(jié)果

    3株產(chǎn)酸克雷伯菌之間的脈沖場凝膠電泳條帶數(shù)目及位置相同,且多位點(diǎn)序列都屬于ST2型。此外,依據(jù)醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn),引起患兒的感染都屬于醫(yī)院感染。因此,依據(jù)臨床資料、菌株分離時(shí)間、脈沖場凝膠電泳和多位點(diǎn)序列實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明攜帶blaNDM-1基因ST2型產(chǎn)酸克雷伯菌在新生兒中存在醫(yī)院感染的克隆聚集流行。結(jié)果詳見圖1和表2。

    注:M,lambda ladder PFGE marker ;Lane 1-3,產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11-TJ13

    圖1 XbaI酶切產(chǎn)酸克雷伯菌基因組PFGE圖

    2.3 質(zhì)粒的S1核酸酶切、Southern雜交和復(fù)制子分型結(jié)果

    S1核酸酶切和Southern雜交顯示產(chǎn)酸克雷伯菌攜帶大小約100 kb和275 kb兩個(gè)質(zhì)粒,而接合子僅攜帶約275 kb質(zhì)粒,且兩者攜帶的blaNDM-1基因都位于275 kb 的質(zhì)粒上。另外,基于PCR的質(zhì)粒復(fù)制子分型表明接合子攜帶IncHIB型質(zhì)粒。詳見圖2。

    3 討論

    近幾年來,由于碳青霉烯類抗菌藥物暴露的增加和/或不合理的應(yīng)用,全國許多省市對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的分離率明顯增加[1],甚至有的地區(qū)碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯桿菌分離率超過30%,這使臨床治療面臨很大的困難[1,7]。產(chǎn)酸克雷伯菌與肺炎克雷伯菌一樣,對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶,并可引起人體多部位的感染[7]。

    注:圖(A):M,lambda ladder PFGE marker;Lane 1,S1核酸酶切的產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11;Lane 2,S1核酸酶切的接合子TJC11;圖(B):Lane 3,產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11的 Southern雜交;Lane 4,接合子TJC11的Southern雜交

    圖2 質(zhì)粒的S1核酸酶切PFGE和Southern雜交圖

    在編碼產(chǎn)碳青霉烯酶的產(chǎn)酸肺炎克雷伯菌中,目前已報(bào)道的有VIM-1[8],VIM-2[9],VIM-4[10],KPC-2[7,11,12]、NDM-1[12]和IMP[7,12,13]等基因型。西班牙學(xué)者Pérez的一項(xiàng)研究[8]顯示,在80株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌中,60% (48/80) 為VIM-1型,37.5% (30/80) 為OXA-48,3.7% (30/80) 為 KPC-2,2.5% (30/80) 為KPC-3,僅1.2% (30/80)屬于NDM-1型基因。國內(nèi)徐小紅等報(bào)道[7],在5株耐碳青霉烯類產(chǎn)酸克雷伯菌中,僅有兩株分別檢出IMP-4,KPC-2和IMP-8。但是,我們研究表明這3株產(chǎn)酸克雷伯菌均攜帶blaNDM-1基因,同時(shí)還攜帶多個(gè)其他耐藥基因,如blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因。Pérez的研究還顯示,碳青霉烯酶耐藥基因位于IncL,IncHI2,IncFII,IncN,IncC和 IncP6型質(zhì)粒上,而本研究的blaNDM-1基因位于大小約275 kb的IncHIB型質(zhì)粒上。另外,在Pérez的研究中,12株經(jīng)全基因組測序的產(chǎn)酸克雷伯菌顯示大部分菌株的多位點(diǎn)序列為ST2型,這一點(diǎn)本文研究與其相一致。

    對于碳青酶烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌,國內(nèi)外報(bào)道往往這些菌對其他類抗生素也同時(shí)耐藥[7,8]。但是,這3株產(chǎn)酸克雷伯菌除了對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外,呈現(xiàn)出對氨基糖苷類、喹諾酮類敏感的藥敏表型,具體原因可能與各個(gè)地區(qū)差異等因素有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

    產(chǎn)酸克雷伯菌無論是對碳青霉烯類耐藥株還是敏感株,都可引起成人或新生兒的醫(yī)院感染暴發(fā)[14,15]。導(dǎo)致暴發(fā)的原因除了患者自身的因素外,常與侵入性操作或周圍環(huán)境污染定植等因素有關(guān)。國內(nèi)韓志偉報(bào)道[16]一起由產(chǎn)酸克雷伯菌引起中心靜脈置管后菌血癥的感染。Lowe則報(bào)道由于洗手池污染產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酸克雷伯菌而導(dǎo)致的醫(yī)院感染暴發(fā)[16]。由于本研究是回顧性,未能找到引起克隆聚集的具體原因。

    總之,我們的研究表明,對碳青酶烯類耐藥的ST2型產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機(jī)制是與其攜帶blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因有關(guān),而且在2013年9月-2013年12月期間,新生兒中存在該克隆株的播散。因此,要引起臨床重視,并加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的感控制措施。

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