長鏈非編碼RNA MEG3對胃癌及其遠期預(yù)后的診斷價值

程玉華,連麗麗,董紅梅*，丁 璐

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.胃腸及營養(yǎng)外科;2.神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130041)

胃癌是一種較為常見的消化道腫瘤疾病，其發(fā)病率和死亡率分別位居第4位和低2位[1]。目前CA199、CA724等血清標(biāo)志物對胃癌的診斷有提示作用，但是胃癌的診斷主要依據(jù)胃鏡檢查。早期胃癌經(jīng)手術(shù)切除后生存率可達90%以上，而進展期胃癌生存率僅為30%[2]。故更加簡單和廉價且快速的診斷方式能夠使胃癌患者在早期得到治療。非編碼RNA作為在轉(zhuǎn)錄水平起調(diào)控作用的一種特殊RNA，已被證實參與到許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中，其能控制細胞的增殖凋亡，甚至具有抑制腫瘤生長的作用[3]。因此被認為具備傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物無法比擬的對疾病的診斷、預(yù)后甚至潛在治療的作用。非編碼RNA MEG3被認為是一種具有抑制腫瘤生長的基因[4]，其在組織中的低表達和腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著潛在的關(guān)系。但是否其在所有的胃癌患者組織中均能呈現(xiàn)低表達以及是否能成為血清診斷標(biāo)志物目前尚不明確。故本文通過組織標(biāo)本驗證MEG3對胃癌的診斷價值并分析其低表達對患者遠期生存率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2011年1月—2014年12月因確診為胃癌而就診于吉林大學(xué)第二醫(yī)院的胃腸及營養(yǎng)外科患者89例。全部患者均行手術(shù)治療，癌旁正常組織為距離癌組織邊緣5 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前進行輔助放化療及靶向治療。②腫瘤合并大范圍遠處轉(zhuǎn)移者。③多器官功能衰竭病例。④在院死亡病人或失訪患者。其中男57例，女32例，平均年齡56.9±5.5歲。全部患者一般基本資料詳見表1。本實驗中組織取自的患者知情同意并簽署相應(yīng)文件，本項目經(jīng)吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1全部標(biāo)本均術(shù)中獲得，包括胃癌組織及配對的癌旁正常組織，組織類型由病理科醫(yī)生證實為癌組織及正常胃組織。所有標(biāo)本自手術(shù)取下后迅速放入液氮封存并轉(zhuǎn)運至實驗室。組織RNA提取使用TRIZOL試劑，并進行RNA濃度及純度的檢測，OD260/OD280選擇在1.8-2.0之間的RNA。然后將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分兩步進行并使用All In One cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時定量PCR采用All In One PCR試劑盒，每組樣品均設(shè)3 個重復(fù)。引物設(shè)計根據(jù)Primer-Blast設(shè)計，并經(jīng)Oligo驗證后由華大基因公司輔助合成，具體序列見表1。

表1 熒光定量引物表

1.2.2高通量生物信息分析方法 長鏈非編碼RNA芯片GSE105476來源于GEO數(shù)據(jù)庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。其中GSE105476包含5例胃癌組織組織和5例癌旁正常組織。通過GEO2R軟件進行差異表達統(tǒng)計分析，差異表達篩選標(biāo)準(zhǔn)為(差異倍數(shù)在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7進行差異基因的火山圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 MEG3對胃癌患者年齡、性別、組織大小、分化程度的診斷價值MEG3在胃癌組織中呈現(xiàn)相對低表達水平，診斷陽性率可達100%。RT-PCR檢測結(jié)果顯示胃癌組織表達水平(7.47±0.35)較正常組織(9.68±0.42)存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中MEG3在腫瘤的分化程度上呈現(xiàn)差異性表達，但在年齡、性別、腫瘤大小方面無明顯差異，詳見表2。

2.2芯片分析結(jié)果顯示總共對13055個基因進行檢測，其中11013個基因無明顯變化，626個上調(diào)差異性表達的基因，1416個下調(diào)差異性表達的基因。對上述數(shù)據(jù)進行火山圖差異表達基因繪制，其中圓圈代表無明顯差異基因，菱形代表差異上調(diào)基因，星號代表差異下調(diào)基因，顯示如圖1。

表2 2組患者一般資料及表達量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

*P<0.05，表中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或例表示

2.3 MEG3表達量對胃癌患者預(yù)后的診斷價值Kaplan Meier曲線顯示MEG3低表達病人預(yù)后較高表達病人預(yù)后差，中位生存時間分別為24.7個月和32.3個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。TCGA數(shù)據(jù)庫顯示MEG3在胃癌患者年齡和性別方面表達無明顯差異(P<0.05)，見圖3。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織差異表達基因火山圖

菱形◇代表差異上調(diào)基因，星號?代表差異下調(diào)基因，圓圈●代表無差異表達基因。

圖2 Kaplan Meier曲線顯示MEG3高低表達病人預(yù)后

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示MEG3差異性表達病人無病生存率

3 討論

胃癌作為較為普遍的一種消化道腫瘤，如何能夠在疾病早期進行快速的診斷是目前研究熱點。胃鏡檢查因價格較貴且檢查費時費力，患者感覺痛苦顯然不適合大量的人口普查。血清診斷標(biāo)志物能夠快速準(zhǔn)確的提供疾病的診斷信息，而且檢查方便價格低廉適合大量人口普查[5]。目前消化道腫瘤血清診斷標(biāo)志物種類較多，包括CA125、CEA、CA199、CA724等，但是診斷特異性較低，需要聯(lián)合檢查或輔助其他檢查手段。非編碼RNA[6]的發(fā)現(xiàn)給疾病的早期診斷甚至治療提供了新的新思路，特別是非編碼RNA在腫瘤組織中的廣泛存在并參與腫瘤細胞的增殖生長及凋亡，可能在編碼RNA發(fā)生改變前即發(fā)生差異性改變，而且非編碼RNA在體液中廣泛存在，具備血清標(biāo)志物的潛能。

既往研究報道，胃癌組織及患者血液中會產(chǎn)生大量差異性表達的長鏈非編碼RNA，其中LncRNA ncRuPAR[7]對胃癌組織的診斷率達到81.2%，LncRNA HMlincRNA717也在胃癌組織中發(fā)生下調(diào)表達，LncRNA FER1L4和LncRNA FENDRR均在胃癌組織中差異表達。本文選擇MEG3不僅是因為其已經(jīng)證實在胃癌組織中呈現(xiàn)差異性表達，更是因為MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)具備抑制腫瘤生長的長鏈非編碼基因，其可以通過競爭性吸附miRNA21抑制胃癌細胞發(fā)生癌變，也可以通過調(diào)控DNA甲基化從而影響胃癌細胞的增生和凋亡。像較為著名的P53抑癌基因，MEG3也被證實可能通過調(diào)控P53的活性進而發(fā)揮抑癌功能[8]，從而有望成為胃癌診斷的血清腫瘤標(biāo)志物。

本文通過RT-PCR對胃癌組織中MEG3的檢測發(fā)現(xiàn)幾乎全部的胃癌組織中均低表達此基因。而且低表達此基因的患者預(yù)后均較差。前人研究發(fā)現(xiàn)MEG3的低表達和腫瘤細胞的分化程度及轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，和本文研究相一致，說明對MEG3的檢測可以作為胃癌的血清診斷標(biāo)志物。而既往研究發(fā)現(xiàn)低表達組MEG3患者的遠期存活率也較低。本文通過生存曲線也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，因此說明對MEG3的檢測可以預(yù)測胃癌術(shù)后患者的遠期生存率，從而可以更加積極的在術(shù)后行輔助性放療或化療，從而提高患者遠期生存率。MEG3作為首個具有抑癌作用的非編碼RNA，其與P53途徑、Rb途徑及影響血管生成均有關(guān)，說明MEG3可能是胃癌發(fā)生的首要變化基因，針對此基因進行干擾如研發(fā)靶向治療藥物可能會發(fā)揮治療及改善胃癌術(shù)后遠期預(yù)后的效果。

總之，本文研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中過低表達的MEG3可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的一種重要改變，并可通過對MEG3的檢測來預(yù)測患者胃癌的分化程度及遠期生存率，針對MEG3的檢測可能在早期為胃癌提供診斷信息。