槐杞黃對(duì)OVA 誘導(dǎo)哮喘模型大鼠嗜酸性細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)因子的影響

伍旭明 許亞萍

哮喘是常見的肺部疾病，主要表現(xiàn)為慢性炎癥以及氣道組織重構(gòu)。研究者用生物標(biāo)記法研究氣道炎癥的相關(guān)表型有嗜酸性細(xì)胞激活[1]、白三烯分泌[2]，以及中性細(xì)胞激活[3]。氣道炎癥細(xì)胞如嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，黏液分泌增多和氣道阻力。研究證明，氣道炎癥與Th1/Th2 免疫失衡相關(guān)，在氣道受到刺激物刺激時(shí)炎癥因子2 型輔助性T 細(xì)胞（Th）反應(yīng)被激活，嗜酸性細(xì)胞和肥大細(xì)胞以及Th2 型細(xì)胞因子如IL-5 等大量分泌，致使氣道炎癥加劇[4]。近年研究表明，輔助性T 細(xì)胞17（Th17）及其相關(guān)因子在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著關(guān)鍵的作用?；辫近S顆?？捎行Ц纳瓶人宰儺愋韵–VA）患兒體液免疫和細(xì)胞免疫，同時(shí)可調(diào)節(jié)Th1/Th2 的細(xì)胞免疫平衡，降低哮喘非急性發(fā)作期患兒IgE，改善肺功能，有助于提高CVA患兒免疫功能，改善愈后，降低復(fù)發(fā)率[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，槐杞黃可一定程度改善卵蛋白（OVA）誘導(dǎo)的哮喘模型大鼠氣道白介素（IL-13）、嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）分泌，因而改善氣道炎癥[8-9]。還可能通過調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞，進(jìn)而影響白介素（IL-17）介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞炎癥，提高哮喘治愈率[10]。為進(jìn)一步研究槐杞黃對(duì)抗EOS性氣道炎癥的作用，本研究從Th1/Th2 以及Th17 免疫途徑出發(fā)，通過復(fù)制哮喘模型大鼠，觀察槐杞黃對(duì)炎癥反應(yīng)中炎癥細(xì)胞、促炎細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞凋亡因子的作用，觀察槐杞黃對(duì)哮喘模型大鼠的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)SD 大鼠60 只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證：SCXK（浙）2014-0001，動(dòng)物倫理批件號(hào)：1408003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在12h 日光12h 黑夜，26℃室溫，60%濕度環(huán)境下飼養(yǎng)，大鼠自由飲水采食。所有實(shí)驗(yàn)操作符合3R 原則（減少、替代、優(yōu)化）給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑 槐杞黃顆粒（批號(hào)20161201，啟東蓋天力藥業(yè)有限公司）。醋酸地塞米松片（批號(hào)140309，浙江仙琚制藥股份有限公司）。Albumin Egg（Sigma A5253 Grade Ⅱ，CAS＃A8040，上海澤衡生物科技有限公司）；大鼠免疫球蛋白E（IgE），大鼠白介素5（IL-5），大鼠白介素3（IL-3），大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞（GM-CSF），大鼠白介素17（IL-17）（批號(hào)20150402B，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司）。瑞士吉姆薩染色液（批號(hào)150630，杭州濱和微生物試劑有限公司）。Trizol[SK1312，生工生物工程（上海）股份有限公司]。GoScriptTMReverse Transcription System（A5000/A5001）。Power SYBR Green PCR Master Mix and Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、人核因子κB（NF-κB）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，批號(hào)150328，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器 PARI TurboBOY N（BR 060400；PARI GmbH，德國(guó)）。醫(yī)用超聲霧化器（BSE2A，北京亞都醫(yī)藥科技有限公司）。Sartorius 純水儀，arium 611VF，購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司。電子分析天平，AB104-N，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自Power Wave xs。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及哮喘動(dòng)物模型建立 60 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、槐杞黃組、槐杞黃聯(lián)合地塞米松組，每組12 只。參照文獻(xiàn)[11]方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立哮喘模型大鼠。致敏：在第1 天和第7天時(shí)，模型組和給藥組大鼠腹腔注射10%卵清白蛋白和氫氧化鋁粉末致敏液1mL。

2.2 給藥 大鼠致敏第14 天起，地塞米松組、槐杞黃組、槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠給予相應(yīng)藥物，槐杞黃給藥劑量為0.4g·100g-1·d-1，地塞米松給藥劑量0.1g·100g-1·d-1，連續(xù)給藥15 天。正常對(duì)照組及模型組大鼠按每只每天給予生理鹽水2mL。模型組、給藥組大鼠在給藥的同時(shí)采用0.1%卵清蛋白溶液進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)時(shí)間30min/次，每天1 次，連續(xù)激發(fā)15天，以模型組和用藥組大鼠出現(xiàn)明顯點(diǎn)頭樣呼吸、呼吸急促、嗆咳、行動(dòng)遲緩、腹肌明顯收縮、嘴唇發(fā)紺、全身瘙癢，甚至大小便失禁、反應(yīng)遲鈍、俯伏不動(dòng)等表現(xiàn)為造模成功。正常對(duì)照組不做處理。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 自主活動(dòng)觀察 觀察造模及給藥前后大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、活動(dòng)、毛發(fā)色澤、呼吸道癥狀、進(jìn)食、死亡等情況。

2.3.2 血清指標(biāo)測(cè)定 末次激發(fā)1h 后，用10%烏拉坦（1300mg/kg，即1.3mL/100g）腹腔注射麻醉大鼠，腹腔下靜脈取血5mL，4℃放置1～2h，4℃3000r/min離心10min。取適量血清，測(cè)定血清IgE、IL-3、IL-5、IL-17 及GM-CSF 水平。

2.3.3 肺泡灌洗液（BALF）白細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞百分比 取血后，氣管插管，結(jié)扎右肺門根部，行左肺支氣管肺泡灌洗，用生理鹽水3mL/次灌洗支氣管肺泡，來回沖洗2 次，灌洗2 次，合并2 次BALF，4℃2000r/min 離心10min。取150μL BALF 液用白細(xì)胞稀釋液1∶2 稀釋，顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)。重懸BALF 液離心后的沉淀，制備3 張涂片，以吉姆斯液染色。每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)400 個(gè)白細(xì)胞，并計(jì)數(shù)其中嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）、單核細(xì)胞（MAC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、中性粒細(xì)胞（NEU）個(gè)數(shù)，計(jì)算各類白細(xì)胞百分比。

2.3.4 肺組織病理 肺泡灌洗后，取未灌洗的肺組織用10%甲醛溶液固定48h 以上，用乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，0.4μm 切片，烤片脫蠟，行HE 染色，觀察肺組織病理變化。

2.3.5 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測(cè)定肺組織Bcl-2/Bax 及NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 取新鮮肺組織適量，加1mL Trizol 從肺組織提取Total RNA。利用2μL 測(cè)定核酸純度，A260/280 在1.8～2.1 之間則提取的RNA 純度較好。所得的RNA保存于-80℃超低溫冰箱。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將反轉(zhuǎn)錄混合液加入RNA 模板混合液中，渦旋混勻，25℃下孵育5min，42℃下孵育60min，70℃下孵育15min。cDNA 樣品放入-20℃保存?zhèn)溆?。用定量試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增定量，觀察基因相對(duì)表達(dá)量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：GAPDH：上游5＇-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3＇，下游5＇-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3＇；NF-κB：上游5＇-GCATTCTGACCTTGCCTATCT-3＇，下游5＇-CTCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3＇；Bcl-2：上游5＇-GGCATCTTCTCCTTCCAGC-3＇，下游5＇-CCCAGCCTCCGTTATCC-3＇；Bax：上游5＇-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3＇，下游5＇-CCAGCCACAAAGATGGTCACT-3＇。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血清IgE、IL-5、IL-3、GM-CSF 及IL-17 水平比較 模型組大鼠血清IgE、IL-5、IL-3、GMCSF 及IL-17 水平明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05 或P<0.01）；與模型組比較，地塞米松組、槐杞黃組和槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠血清IgE 水平顯著降低（P<0.05 或P<0.01）；槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠血清IL-5、IL-3、GM-CSF 及IL-17 水平顯著低于模型組（P<0.05 或P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清IgE、Il-5、Il-3、GM-CSF 及IL-17 水平比較（）

表1 各組大鼠血清IgE、Il-5、Il-3、GM-CSF 及IL-17 水平比較（）

注：正常對(duì)照組為正常大鼠，予生理鹽水；模型組為哮喘模型大鼠予生理鹽水；地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；槐杞黃組為哮喘模型大鼠予0.4g·100g-1·d-1 槐杞黃顆?；鞈乙?；槐杞黃聯(lián)合地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 槐杞黃+0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；IgE 為免疫球蛋白lgE；IL-5 為白介素5；IL-3 為白介素3；GM-CSF 為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；IL-17 為白介素17；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

表2 各組大鼠肺泡盥洗液白細(xì)胞總數(shù)及各類白細(xì)胞百分比比較（）

表2 各組大鼠肺泡盥洗液白細(xì)胞總數(shù)及各類白細(xì)胞百分比比較（）

注：正常對(duì)照組為正常大鼠，予生理鹽水；模型組為哮喘模型大鼠予生理鹽水；地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；槐杞黃組為哮喘模型大鼠予0.4g·100g-1·d-1 槐杞黃顆粒混懸液；槐杞黃聯(lián)合地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 槐杞黃+0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；MAC 為單核細(xì)胞；EOS 為嗜酸粒細(xì)胞；LYM 為淋巴細(xì)胞；NEU 為中性粒細(xì)胞；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

3.2 各組大鼠肺泡盥洗液（BALF）白細(xì)胞總數(shù)及各類白細(xì)胞百分比比較 模型組大鼠BALF 白細(xì)胞總數(shù)及EOS、LYM、NEU 比例明顯高于正常對(duì)照組（P均<0.01），MAC 百分比低于正常對(duì)照組（P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組大鼠BALF 白細(xì)胞總數(shù)及EOS、LYM 比例降低（P 均<0.05），槐杞黃聯(lián)合地塞米松大鼠BALF 白細(xì)胞總數(shù)及EOS、LYM、NEU 比例顯著低于模型組（P 均<0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠肺組織Bcl-2/Bax 及NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 模型組大鼠肺組織Bcl-2/Bax mRNA、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，地塞米松組、槐杞黃組以及槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠肺組織Bcl-2/Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P 均<0.01）；槐杞黃組以及槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠肺組織NFκB mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組（P<0.05）。見表3。

3.4 肺組織病理 各組大鼠肺組織病理切片HE 染色結(jié)果可見，正常組大鼠肺組織肺泡壁結(jié)構(gòu)正常，無增生無增厚，肺泡壁周圍無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道壁較薄，氣道壁周圍無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1A）。模型組大鼠肺組織肺泡壁增生，肺組織被大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，氣道壁明顯增厚（見圖1B）。地塞米松組及槐杞黃組大鼠肺組織可見肺泡壁及氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象有所緩解，肺泡壁及氣道壁較模型組大鼠?。ㄒ妶D1C、D）。槐杞黃聯(lián)合地塞米松組大鼠肺組織可見肺泡壁及氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象明顯緩解，肺泡壁及氣道壁較模型組大鼠明顯?。ㄒ妶D1E）。

表3 各組大鼠肺組織Bcl-2/Bax 及NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠肺組織Bcl-2/Bax 及NF-κB mRNA 表達(dá)水平比較（）

注：正常對(duì)照組為正常大鼠，予生理鹽水；模型組為哮喘模型大鼠予生理鹽水；地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；槐杞黃組為哮喘模型大鼠予0.4g·100g-1·d-1 槐杞黃顆?；鞈乙?；槐杞黃聯(lián)合地塞米松組為哮喘模型大鼠予0.1g·100g-1·d-1 槐杞黃+0.1g·100g-1·d-1 地塞米松混懸液；Bcl-2 為B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白；Bax 為Bcl-2 相關(guān)x 蛋白；NF-κB 為核轉(zhuǎn)錄因子κB；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP<0.01

圖1 各組大鼠肺組織病理（HE 染色×20）

4 討論

免疫-炎癥反應(yīng)是哮喘發(fā)病主要機(jī)制之一，T 細(xì)胞被抗原激活，活化的輔助性T 細(xì)胞（主要是Th2 細(xì)胞）產(chǎn)生的白細(xì)胞介素進(jìn)一步激活B 淋巴細(xì)胞，后者合成特異性IgE，并結(jié)合于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等表面的IgE 受體。若變應(yīng)原再次進(jìn)入體內(nèi)便可引起體內(nèi)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致平滑肌收縮、黏液分泌增加、血管通透性增高和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。研究表明，IL-17 在哮喘患者的外周血、支氣管黏膜、肺組織、支氣管BALF 和誘導(dǎo)痰中表達(dá)量增加[12-14]。Th17 細(xì)胞可分泌炎癥細(xì)胞因子IL-17F、IL-6 以及TNF-α 等，加重炎癥反應(yīng)[1]。本實(shí)驗(yàn)中，OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型大鼠可見BALF 白細(xì)胞總數(shù)、EOS、LYM 以及NEU 比例明顯升高，血清IgE 及IL-17 顯著上升，肺組織病理顯示肺泡壁及氣道壁增厚，組織周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。給予地塞米松、槐杞黃及兩藥合用可明顯降低哮喘模型大鼠BALF 白細(xì)胞總數(shù)、EOS、LYM 以及NEU 比例，可降低血清IgE 及IL-17 水平，減少肺泡壁及氣道壁增厚程度和組織周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。

EOS 由骨髓多能干細(xì)胞分化，通過內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子及對(duì)應(yīng)配體進(jìn)入組織，后經(jīng)趨化因子激活[1]。EOS 被發(fā)現(xiàn)在哮喘模型鼠的血、肺組織、BALF和胸腔淋巴結(jié)中數(shù)量明顯升高[15]。IL-3、IL-5 和GMCSF 可調(diào)節(jié)EOS 生成以及激活[16]。此外，EOS 的凋亡減少是除EOS 生成之外另一個(gè)使EOS 增多的原因之一，EOS 凋亡程度還影響著哮喘支氣管氣道炎癥的發(fā)展。Bcl-2 為抑制細(xì)胞凋亡基因，Bax 為促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，被公認(rèn)為細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因[17]，兩者的比例決定了細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激是否發(fā)生凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)中，OVA 誘導(dǎo)哮喘模型大鼠血清IL-3、IL-5 和GM-CSF 明顯升高，肺組織Bcl-2/Bax mRNA 比例顯著升高?；辫近S聯(lián)合地塞米松干預(yù)明顯下調(diào)哮喘模型大鼠血清IL-3、IL-5、IL-17 和GMCSF 水平，以及肺組織Bcl-2/Bax mRNA 表達(dá)。

NF-κB 與多種免疫性和炎癥性疾病密切相關(guān)，包括哮喘氣道炎癥，其可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、粘附分子以及趨化因子的轉(zhuǎn)錄，并可調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞凋亡[19]?；罨腘F-κB 促進(jìn)各炎癥因子的表達(dá)增強(qiáng)，引起肺內(nèi)中性細(xì)胞浸潤(rùn)，使得肺部大量積聚、粘附、浸潤(rùn)并釋放大量氧自由基、蛋白酶等炎癥介質(zhì)損傷肺組織[20]。本實(shí)驗(yàn)中，OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型大鼠肺組織NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組大鼠（P<0.05），槐杞黃及槐杞黃聯(lián)合地塞米松可使哮喘模型大鼠肺組織NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，緩解哮喘模型大鼠氣道炎癥，起到保護(hù)肺組織的作用。

綜上所述，槐杞黃輔助治療可能通過糾正OVA誘導(dǎo)哮喘模型大鼠Th1/Th2 以及Th17 免疫失衡，促進(jìn)EOS 凋亡，下調(diào)哮喘促炎因子NF-κB 表達(dá)，以達(dá)到緩解哮喘模型大鼠氣道炎癥的作用。