高濃度維生素B6注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)驗證

沈 娟，蘆佳月，羅曉茹，王習(xí)文（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊藥品儀器監(jiān)督檢驗總站，北京 100071）

維生素B6是一種水溶性維生素，遇光或堿易被破壞，不耐高溫；是制造抗體和紅細(xì)胞的必要物質(zhì)[1]；對嬰兒的大腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育亦至關(guān)重要[2]。可用于治療因大量或長期服用異煙肼等引起的周圍神經(jīng)炎、失眠、不安；減輕抗癌藥和放射治療引起惡心、嘔吐或妊娠嘔吐等[3]；治療或預(yù)防嬰兒驚厥；治療白細(xì)胞減少癥、痤瘡、酒糟鼻、脂溢性濕疹等[4-6]。注射用維生素B6其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查已有報道[7]，維生素B6注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也已被載入《中華人民共和國藥典（二部）》2015年版[8]，其中包括了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項，但藥典中該品種項下的藥物濃度最高為50 mg/ml，而125 mg/ml高濃度維生素B6注射液其細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查未見相關(guān)報道。為了更好地控制該注射劑的質(zhì)量，筆者參照《中國藥典》2015年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法[8]，對維生素B6注射液用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性研究。

1 試驗材料

1.1 供試品

維生素B6注射液由軍事科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供（批號：1905131、1904261、1905132，規(guī)格20 ml：2.5 g）。

1.2 試劑

鱟試劑（福州新北生化工業(yè)有限公司，0.25 EU/ml，批號：19010812；0.06 EU/ml，批號：19050112；湛江安度斯生物有限公司，0.06 EU/ml，批號：1903132）；Tris緩沖液（湛江安度斯生物有限公司，批號：1904230；規(guī)格：每支4 ml）；鎂離子緩沖液（湛江安度斯生物有限公司，批號：1901310；規(guī)格：每支4 ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201886，規(guī)格：每支80 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET, bacterial endotoxin test水，中國食品藥品檢定研究院，批號：160006-201510；規(guī)格：每支5 ml）。

1.3 儀器

SSW-600-2S電熱恒溫水槽（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；其他器皿包括試管、微量移液器及無熱原吸頭。

2 方法與結(jié)果

2.1 限值的確定

本品為在研的維生素類制劑，其說明書用法用量為：“臨用前以250 ml乳酸鈉林格氏液稀釋后靜脈滴注。依病情，首次給予相當(dāng)于維生素B61～5 g快速滴注?！钡弥酒返淖畲蠼o藥劑量為5 g/(60 kg·h)。根據(jù)公式L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，則限值L=0.06 EU/mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

按照《中國藥典》2015年版四部通則1143[9]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，對鱟試劑進(jìn)行靈敏度(λc)復(fù)核。3批鱟試劑靈敏度測定值λc均在0.5～2.0 λ之間，均符合規(guī)定，3批鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果皆為標(biāo)示靈敏度。詳見表1。

表1 3批鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.3 干擾試驗預(yù)試驗

2.3.1 維生素B6注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計算

最大有效稀釋倍數(shù)計算公式為：MVD=cL/λ，式中：L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.06 EU/mg；c為供試品溶液濃度；λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度（EU/ml）。

根據(jù)市售鱟試劑靈敏度λ范圍0.5～0.03 EU/ml，對維生素B6注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時，用0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml的鱟試劑分別對應(yīng)有效稀釋倍數(shù)：15、30、60、120、240倍，分別對應(yīng)有效稀釋濃度：8.33、4.17、2.08、1.04、0.52 mg/ml。

由于供試品pH偏酸性（pH2～3），不在細(xì)菌內(nèi)毒素測定的合適范圍內(nèi)，因此需先調(diào)節(jié)pH至6.0～8.0，再進(jìn)行測定。前期試驗發(fā)現(xiàn)，用0.25 EU/ml的鱟試劑，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液作為pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行內(nèi)毒素試驗，結(jié)果存在一定程度的干擾。

目前市售的pH緩沖液有湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鎂離子緩沖液（pH6.5～7.5）和Tris緩沖液（pH6.5～7.5），擬用市售的緩沖液代替0.1 mol/L氫氧化鈉溶液對供試品進(jìn)行稀釋和pH調(diào)節(jié)，再進(jìn)行干擾試驗。

2.3.2 試驗操作及結(jié)果

用其中一批供試品（批號：1905132）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾預(yù)實驗。將維生素B6注射液用鎂離子緩沖液（以下簡稱“稀釋劑Ⅰ”）分別稀釋至8.33、4.17、2.08、1.04、0.52 mg/ml，此系列濃度溶液為不含內(nèi)毒素的供試品溶液（NPC：negtive product control），另制備含有2λ（0.5 EU/ml）濃度細(xì)菌內(nèi)毒素的相同系列濃度的供試液，此系列溶液為含內(nèi)毒素的供試品溶液（PPC：positive product control）。

取靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑，分別與NPC和PPC系列溶液反應(yīng)，每一濃度設(shè)2支復(fù)管，同時設(shè)陽性對照（PC：positive control）、陰性對照（NC）、稀釋劑Ⅰ陰性對照（ⅠNC）、稀釋劑Ⅰ陽性對照（ⅠPC），結(jié)果見表2。

表2 維生素B6注射液用稀釋劑Ⅰ稀釋和pH調(diào)節(jié)后的干擾預(yù)試驗結(jié)果

用Tris緩沖液（以下簡稱“稀釋劑Ⅱ”）進(jìn)行與稀釋劑Ⅰ同樣的干擾預(yù)試驗，結(jié)果見表3。

表3 維生素B6注射液用稀釋劑Ⅱ稀釋和pH調(diào)節(jié)后的干擾預(yù)試驗結(jié)果

結(jié)果表明：以稀釋劑Ⅰ（或稀釋劑Ⅱ）對供試品進(jìn)行稀釋和pH調(diào)節(jié)，供試品溶液濃度在1.04 mg/ml及以下對鱟試劑和內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無干擾。而1.04 mg/ml對應(yīng)的鱟試劑靈敏度為0.06 EU/ml，故宜選用0.06 EU/ml及0.06 EU/ml以上靈敏度的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.4 正式干擾試驗

采用兩個廠家生產(chǎn)的鱟試劑對3批維生素B6注射液(批號：1905131、1904261、1905132)進(jìn)行正式干擾試驗。試驗選擇靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行，對應(yīng)最小有效稀釋濃度為1.04 mg/ml。用稀釋劑Ⅰ和稀釋劑Ⅱ分別對供試品進(jìn)行稀釋和pH調(diào)節(jié)，再進(jìn)行干擾試驗研究。

制備含有0.125（2 λ）、0.06（1 λ）、0.03（0.5 λ）和0.015（0.25 λ）EU/ml內(nèi)毒素濃度的1.04 mg/ml的供試品溶液，每一濃度設(shè)4支復(fù)管；用BET水和稀釋劑Ⅰ分別制備0.125（2 λ）、0.06（1 λ）、0.03（0.5 λ）和0.015（0.25 λ）EU/ml內(nèi)毒素系列溶液，每一濃度設(shè)2支復(fù)管；并分別設(shè)NC 2支。與靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)，按《中國藥典》2015版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法[8]干擾試驗規(guī)定進(jìn)行試驗，結(jié)果見表4。

表4 稀釋劑Ⅰ稀釋維生素B6注射液干擾試驗結(jié)果

按照上述（用稀釋劑Ⅰ稀釋）方法，用稀釋劑Ⅱ進(jìn)行干擾試驗，結(jié)果見表5。

由表4和表5可知：平行3批次干擾試驗中陰性對照溶液NC、稀釋劑對照溶液ⅠNC（或ⅡNC）、供試品溶液NPC的所有平行管均為陰性，兩個廠家鱟試劑標(biāo)示靈敏度對照系列的結(jié)果λc在0.5～2 λ之間（包括0.5 λ和2 λ），符合靈敏度復(fù)核要求，試驗有效。兩個廠家鱟試劑干擾試驗系列的結(jié)果（Et）為0.5～2 λ（包括0.5 λ和2 λ），符合規(guī)定。表明供試品稀釋至1.04 mg/ml時，采用0.06 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗無干擾，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑，按本研究建立的檢查法用兩個廠家的鱟試劑對3批維生素B6注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素常規(guī)檢查。維生素B6注射液用稀釋劑I和稀釋劑Ⅱ進(jìn)行供試品稀釋和pH調(diào)節(jié)后，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果相同，皆符合規(guī)定。結(jié)果見表6。

表5 稀釋劑Ⅱ稀釋維生素B6注射液干擾試驗結(jié)果

表6 維生素B6注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

3 討論

《中國藥典（二部）》2015年版收載的維生素B6注射液品種，內(nèi)毒素的限值為每1 mg維生素B6中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.30 EU[8]。由于本供試品規(guī)格和濃度在《中國藥典》2015年版中未涵蓋，且由于本品說明書中的用量較大，根據(jù)說明書的用法用量及《注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》[9]，計算出本品內(nèi)毒素的限值為：每1 mg維生素B6中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.06 EU，比藥典規(guī)定的限值提出了更高的要求，試驗中需要切實解決干擾問題。

經(jīng)過一系列試驗摸索，最終以市售的湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鎂離子緩沖液（pH6.5～7.5）和Tris緩沖液（pH6.5～7.5）對供試品進(jìn)行稀釋和pH調(diào)節(jié)。經(jīng)預(yù)實驗可知，將供試品稀釋120倍以下對凝膠法內(nèi)毒素檢查存在抑制性干擾，稀釋120倍及以上對凝膠法內(nèi)毒素檢查無干擾，并通過正式干擾試驗得到驗證。試驗結(jié)果表明：以pH6.5～7.5緩沖液稀釋本品至1.04 mg/ml，用靈敏度為0.06 EU/ml鱟試劑對供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，方法可行。