牡丹籽油復(fù)方軟膠囊增強(qiáng)免疫力的功能研究

張夢蘭，楊 琴，張冰潔，王洪新，馬朝陽

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

牡丹籽油是一種新型食用油脂，已于2011年獲批為新資源食品。牡丹籽油中富含不飽和脂肪酸(>82%)，主要成分為α-亞麻酸(>38%)，還含有黃酮、甾醇等多種藥理活性成分[1]。研究表明，牡丹籽油具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、免疫增強(qiáng)、保護(hù)急性肝損傷等多種功效[2-6]。另外，姚思宇等[7]研究表明，α-亞麻酸能增強(qiáng)小鼠的免疫力，提高NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力。

茶葉提取物可以回升荷瘤小鼠的T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，其中：茶氨酸可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性和NK細(xì)胞活性；茶葉多糖可以顯著增強(qiáng)IL-2、IFN-γ 水平；茶多酚可提高血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的含量,可延緩胸腺衰退，保護(hù)淋巴細(xì)胞受損，促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)人體免疫功能[8-12]。

苦瓜果肉可誘導(dǎo)IFN-γ 產(chǎn)生，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的激活；苦瓜提取液可以明顯增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫和體液免疫功能，其中苦瓜皂甙可通過改變T細(xì)胞各亞群比例,促進(jìn)脾臟分泌IL-2,增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力和吞噬指數(shù)；苦瓜多糖能刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅、分泌NO的能力[13-16]。

現(xiàn)代社會(huì)忙碌的工作和學(xué)習(xí)使得免疫力低下的亞健康人群增多，關(guān)于增強(qiáng)免疫力保健品的研究也越來越多。因此，我們選擇了上述3種可以增強(qiáng)免疫力的食品原料復(fù)配以期達(dá)到多靶點(diǎn)、多途徑增強(qiáng)免疫力的目的，并且按照衛(wèi)生部頒布的《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范 增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法(征求意見稿)》(2012版)的要求，對由上述3種原料組成的牡丹籽油復(fù)方軟膠囊的增強(qiáng)免疫功效進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試物

牡丹籽油復(fù)方軟膠囊(內(nèi)容物配方為牡丹籽油、茶葉提取物、苦瓜提取物，三者質(zhì)量比15∶5∶3)，由安徽哈博藥業(yè)有限公司提供，人體推薦量0.06 g/(kg·d)；牡丹籽油(α-亞麻酸含量>38%)，銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司；茶葉提取物(茶多酚含量>30%)，遵義陸圣康源有限公司；苦瓜提取物(苦瓜總皂甙含量>1.5%)，桂林萊茵生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2013-0018，SPF級，雄性，體重18～22 g。小鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2016-0045，實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件為室溫20～26℃、相對濕度40%～70%、光照/黑暗周期12 h/12 h。

1.1.3 主要試劑

刀豆蛋白A(ConA)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；2,4-二硝基氟苯(DNFB)、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液、Hank’s液、豚鼠血清、瓊脂糖、二甲氧唑黃(XTT)試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；印度墨汁，北京化學(xué)試劑公司；YAC-1細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫；單分散熒光微球(聚苯乙烯微球)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、硫化鋇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。完全培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺(200 mmol/L)、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/L)及5×10-5mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.2。ConA液：用雙蒸水配制成100 μg/mL的溶液，過濾除菌，于-20℃保存。

1.1.4 主要儀器

UV-2100紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；ELISA全自動(dòng)酶標(biāo)儀，濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜，賽默飛世爾科技公司；耳腫打孔器，北京環(huán)球生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)(XTT法)

脫頸椎處死小鼠，無菌取脾，將脾磨碎后，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×107個(gè)/mL，取100 μL加入96孔板；用完全培養(yǎng)基分別配制牡丹籽油、茶葉提取物和苦瓜提取物不同濃度的樣液，對照組加100 μL完全培養(yǎng)基，過無菌濾膜，加入上述培養(yǎng)板中，每個(gè)樣做6個(gè)平行，其中3個(gè)孔加入7.5 μL ConA液，分別加入完全培養(yǎng)基補(bǔ)足體積至200 μL，使得培養(yǎng)時(shí)樣品質(zhì)量濃度分別為4、6、8 mg/mL。在CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，結(jié)束前4 h加入XTT，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測光密度。計(jì)算不加ConA的孔和加入ConA的孔的光密度差值[17]，以光密度差值表征淋巴細(xì)胞體外增殖能力。

培養(yǎng)方法同上，以8 mg/mL為總作用質(zhì)量濃度，根據(jù)牡丹籽油復(fù)方軟膠囊3種成分比例計(jì)算得到牡丹籽油、茶葉提取物、苦瓜提取物的質(zhì)量濃度分別為5.22、1.74、1.04 mg/mL，以對照組、牡丹籽油組(A組)、茶葉提取物組(B組)、苦瓜提取物組(C組)、牡丹籽油+茶葉提取物組(A+B組)、牡丹籽油+苦瓜提取物組(A+C組)、茶葉提取物+苦瓜提取物組(B+C組)和牡丹籽油+茶葉提取物+苦瓜提取物組(A+B+C組)為受試樣液，測定各組對淋巴細(xì)胞的體外增殖能力。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥

將160只小鼠隨機(jī)分為4個(gè)大組：免疫I組，進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性的測定；免疫Ⅱ組，進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和臟體比測定；免疫Ⅲ組，進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)，抗體生成細(xì)胞數(shù)的測定；免疫Ⅳ組，進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)。每個(gè)大組隨機(jī)分為4個(gè)小組，每組10只，分別為陰性對照組和低、中、高劑量組。

以人體推薦攝入量的5、10、30倍，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量組，分別為0.3、0.6、1.8 g/(kg·d)，其中α-亞麻酸劑量分別為74.4、148.8、446.4 mg/(kg·d)。小鼠灌胃體積為10 mL/kg。取牡丹籽油復(fù)方軟膠囊內(nèi)容物3、6、18 g，分別用1%羧甲基纖維素鈉水溶液定容至100 mL，即為不同質(zhì)量濃度的灌胃劑。各組灌胃給予受試物，陰性對照組給予等體積1%羧甲基纖維素鈉水溶液，每天1次，連續(xù)灌胃1個(gè)月。

1.2.3 臟體比測定

脫頸椎處死動(dòng)物，取其胸腺及脾臟，稱重，計(jì)算胸體比和脾體比。

1.2.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(XTT法)

脫頸椎處死動(dòng)物，無菌取脾，將脾磨碎后，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×107個(gè)/mL，取100 μL加入96孔板，每個(gè)動(dòng)物做4個(gè)平行，其中2個(gè)孔加入7.5 μL ConA液，2個(gè)孔不加，然后所有孔加入完全培養(yǎng)基補(bǔ)足體積至200 μL，在CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，結(jié)束前4 h加入XTT，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測每孔的光密度。計(jì)算不加ConA的孔和加入ConA的孔光密度的差值[18]。

1.2.5 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)

在給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束前6 d，每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3 cm×3 cm，用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊。攻擊24 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重，并計(jì)算左右耳片的質(zhì)量差[18]。

1.2.6 抗體生成細(xì)胞數(shù)的測定

在給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%壓積SRBC，5 d后脫頸椎處死小鼠，脾細(xì)胞磨碎后用RPMI 1640培養(yǎng)基制備成(5～10)×106個(gè)/mL 的懸液，在底層培養(yǎng)基(0.5 g瓊脂糖加入100 mL滅菌生理鹽水中，加熱溶解，50℃左右時(shí)，以1 mL/孔的量加至6孔培養(yǎng)板中，瓊脂凝固后備用)上加入脾細(xì)胞懸液和頂層培養(yǎng)基(0.5 g瓊脂糖加入100 mL Hank’s液(pH 7.2～7.4)中,加熱溶解，以0.5 mL/試管的量加至46～50℃恒溫的試管中)，將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后每孔加入500 μL補(bǔ)體，繼續(xù)孵育2 h，自動(dòng)圖像分析儀讀取溶血空斑圖像,分析軟件計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)[18]。

1.2.7 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

每鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，注射量按0.1 mL/10 g計(jì)算，待墨汁注入后，立即計(jì)時(shí)。注入墨汁后第2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長處測定光密度。第二次采血結(jié)束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)[18]。

式中：OD1和OD2分別為血樣在2、10 min時(shí)測定的光密度。

1.2.8 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)

脫頸椎處死小鼠，腹腔注射3 mL加胎牛血清的Hank’s液，輕輕按揉腹部充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔洗液2 mL，用75 μm過濾器過濾至試管內(nèi)，調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為(4～6)×105個(gè)/mL,取1 mL于6孔培養(yǎng)板中，加入熒光微球，CO2培養(yǎng)箱37℃避光孵育90～120 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，吹打均勻，過濾，上流式細(xì)胞儀檢測分析，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)[18]。

吞噬率=吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的熒光微球總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1.2.9 NK細(xì)胞活性的測定

無菌取小鼠的脾，將脾磨碎并裂解紅細(xì)胞后，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×107個(gè)/mL，調(diào)整靶細(xì)胞(YAC-1)濃度至4×105個(gè)/mL，在U型96孔板中加入100 μL靶細(xì)胞和100 μL效應(yīng)細(xì)胞(NK細(xì)胞)即為反應(yīng)孔，加入100 μL靶細(xì)胞和100 μL培養(yǎng)液即為自然釋放孔，加入100 μL靶細(xì)胞和100 μL 2.5% Triton即為最大釋放孔。于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，離心后吸取上清液100 μL于平底96孔板中，加入LDH，反應(yīng)3 min后加入250 μL 0.4 mol/L NaOH溶液，測定490 nm處的光密度，并計(jì)算NK細(xì)胞活性[18]。

NK細(xì)胞活性=(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100%

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK 細(xì)胞活性4個(gè)方面任何2個(gè)方面結(jié)果為陽性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力的功能。在每個(gè)方面需要該方面下的2個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，或NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)的1個(gè)以上劑量結(jié)果為陽性，才能判定該方面的結(jié)果為陽性[17-18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試物對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力的影響(見表1、表2)

表1 3種質(zhì)量濃度受試物對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力的影響

由表1可知，茶葉提取物在4、6、8 mg/mL時(shí)均可以顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力，苦瓜提取物在6、8 mg/mL時(shí)可以顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力，而牡丹籽油在8 mg/mL時(shí)能顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力。在相同質(zhì)量濃度時(shí)，茶葉提取物增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力的效果最好。

表2 在復(fù)方軟膠囊配方比例下受試物對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力的影響

由表2可知，在復(fù)方軟膠囊的配方比例下，苦瓜提取物對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖能力幾乎沒有增強(qiáng)效果，茶葉提取物和牡丹籽油則具有顯著增強(qiáng)效果，且茶葉提取物的效果強(qiáng)于牡丹籽油，3種成分之間并不具有拮抗作用。該配方中，茶葉提取物起主要作用，牡丹籽油次之，最后是苦瓜提取物。

2.2 受試物對小鼠體重的影響(見表3)

表3 受試物對小鼠體重增長率的影響

由表3可知，各大組的3種劑量組的小鼠體重增長率與陰性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。說明受試物不會(huì)影響正常小鼠的體重。

2.3 受試物對小鼠臟體比的影響(見表4)

表4 受試物對小鼠臟體比的影響

由表4可知，與陰性對照組比較，3個(gè)劑量組小鼠胸體比與脾體比均無顯著性差異(P>0.05)。說明不能通過增加免疫器官的質(zhì)量來發(fā)揮增強(qiáng)免疫力的作用。

2.4 受試物對ConA 誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(見表5)

表5 受試物對ConA 誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

由表5可知，各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力均增加，與陰性對照組比較，中劑量組差異顯著(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。這說明受試物能顯著增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。有研究表明茶多酚可保護(hù)淋巴細(xì)胞受損、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，這可能是脾臟中原始細(xì)胞向T細(xì)胞分化的結(jié)果；苦瓜皂甙和α-亞麻酸均可以增強(qiáng)CD8+細(xì)胞的增殖，降低CD4+/CD8+比值，改善機(jī)體免疫狀態(tài)；苦瓜多糖能刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖[12,15-16，19]。

2.5 受試物對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響(見表6)

表6 受試物對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

由表6可知，各劑量組小鼠左右耳質(zhì)量差值均增加，與陰性對照組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。這說明該受試物可以顯著增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能。有研究表明給藥量為88.8 mg/kg 純?chǔ)?亞麻酸時(shí)，可顯著增加小鼠左右耳質(zhì)量差值，增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)低劑量組中牡丹籽油的添加量按α-亞麻酸計(jì)為74.4 mg/kg ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致。

2.6 受試物對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響(見表7)

表7 受試物對小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

由表7可知，與對照組比較，各劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)均不具有顯著性差異(P>0.05)。這說明該受試物不能顯著增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。

2.7 受試物對小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)的影響(見表8)

表8 受試物對小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)的影響

由表8可知，高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)與對照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。說明該受試物可以增強(qiáng)小鼠的碳廓清能力。有研究表明給藥量為355.4 mg/kg 純?chǔ)?亞麻酸，可顯著提高小鼠碳廓清能力，本實(shí)驗(yàn)高劑量組α-亞麻酸劑量為446.4 mg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致。

2.8 受試物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的影響(見表9)

表9 受試物對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

由表9可知，與對照組比較，各劑量組小鼠的吞噬率和吞噬指數(shù)差異均不具有顯著性意義(P>0.05)。說明該受試物不能增強(qiáng)小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能。

2.9 受試物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響(見表10)

表10 受試物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

由表10可知，與對照組比較，中、高劑量組小鼠的NK細(xì)胞活性差異均具有極顯著性意義(P<0.01)。說明該受試物可以增強(qiáng)小鼠的NK細(xì)胞活性。有研究表明給藥量為177.7 mg/kg純?chǔ)?亞麻酸，可顯著提高小鼠NK細(xì)胞活性，本實(shí)驗(yàn)中劑量組α-亞麻酸劑量為148.8 mg/kg ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致，同時(shí)茶葉提取物也可以回升荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性[9]。

3 結(jié) 論

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種成分(茶葉提取物，苦瓜提取物和牡丹籽油)在體外均可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力，相同質(zhì)量濃度下茶葉提取物效果最好，苦瓜提取物次之，牡丹籽油最差；在復(fù)方軟膠囊所用的配方比例下，茶葉提取物效果最好，牡丹籽油次之，苦瓜提取物最差。細(xì)胞免疫功能檢測項(xiàng)目中的2個(gè)實(shí)驗(yàn)(小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn))結(jié)果均為陽性，可判定細(xì)胞免疫功能測定結(jié)果陽性。體液免疫功能測定項(xiàng)目中，抗體生成細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果為陰性，可判定體液免疫功能測定結(jié)果為陰性。單核巨噬細(xì)胞功能測定項(xiàng)目中，小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)結(jié)果為陰性，可判定單核巨噬細(xì)胞功能結(jié)果為陰性。NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)中1個(gè)以上劑量組的結(jié)果呈陽性，可判定NK 細(xì)胞活性結(jié)果為陽性。在本實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞免疫功能和NK細(xì)胞活性結(jié)果為陽性，體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能均為陰性，表明牡丹籽油復(fù)方軟膠囊具有增強(qiáng)免疫力功能。