超聲輔助-分散液液微萃取/快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用植物油中黃曲霉毒素

朱筱玲，趙淑娥，羅春麗，熊遠珍

(1.江西省分析測試研究所，南昌 330029； 2.南昌大學 藥學院，南昌 330006)

黃曲霉毒素(AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)類似的系列代謝產(chǎn)物[1]，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)是天然的三致性和免疫抑制毒性之首的劇毒物,攝入高含量AFB1食物的人或動物可能會導致肝癌甚至死亡[2]。食用植物油AFB1超標是因花生、玉米、大豆等原料霉變和生產(chǎn)、加工、運輸、儲藏等環(huán)節(jié)控制不當而受霉菌侵染所致[3]。AFT的耐高溫性與穩(wěn)定性使其很難被殺滅，用紫外線[4]、微波和光催化可解毒[5]，最新研究表明基因工程及拮抗菌有望抑制產(chǎn)毒菌株生長和毒素產(chǎn)生[6]。然而一級預防措施是制定限量標準，GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中植物油脂AFB1限量為(除花生油、玉米油為20 μg/kg外)10 μg/kg。

檢測AFT常用方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法[7]、高效液相色譜-熒光檢測法[8-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-15]等。GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》均把以上方法列入其中。前3種方法操作煩瑣、重現(xiàn)性差，還可能出現(xiàn)假陽性，難以準確定性定量。用免疫親和柱凈化結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術可特異性提取和高靈敏度準確測定黃曲霉毒素[14-15]，但成本高、耗時長。近年納米材料也用于食用油中的AFB1檢測[16]。分散液液微萃取法(DLLME)始于環(huán)境水樣分析前處理[17]，原理是將微升級萃取劑和分散劑的混合液注入萃取體系，在分散劑-樣液相形成萃取劑微珠懸浮于樣液相內(nèi)，大大擴大萃取劑微珠和樣液相接觸面，使被測物轉(zhuǎn)移非常迅速，數(shù)秒內(nèi)達平衡而極大提高了萃取率和富集倍數(shù)。DLLME用于食品黃曲霉毒素檢測所見不多[13,18],與國標方法相比省去凈化、吹干富集等步驟。超聲輔助(UA)有利于分散乳化使AFT萃取更完全。本文采用UA-DLLME技術，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術建立UA-DLLME/RRLC-MS/MS分析食用植物油4種黃曲霉毒素方法，具有簡便、高效，準確度和精密度高的優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

AFB1(1162-65-8)、AFB2(7220-81-7)、AFG1(1165-39-5)、AFG2(7241-98-7)標準溶液，質(zhì)量濃度均為3 μg/mL，1 mL裝，上海安譜科技公司；甲醇、乙腈、正己烷，色譜純，德國Merck公司；乙醇、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)，分析純，西隴科學公司；乙酸銨、甲酸，色譜純，歐盟；實驗用水為屈臣氏飲用水，廣州屈臣氏食品飲料公司。食用植物油為市場抽查的花生油、稻米油、米糠油、菜籽油和調(diào)和油樣品。

6410B型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有1200SL快速液相色譜(RRLC)系統(tǒng)，美國Agilent公司；KQ5200DE超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；XH-B型渦旋混合器，江蘇康健醫(yī)療用品公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準溶液的配制

將AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準溶液(1 mL裝)分別用乙腈定容至10 mL容量瓶中，4種儲備液質(zhì)量濃度均為0.3 μg/mL，4℃冰箱保存。取適量4種標準儲備液用初始流動相稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.50、7.50、15.0、30.0 ng/mL的系列混合標準溶液。

1.2.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件[12]

Luna C18(2)100 ?色譜柱(150 mm×2.0 mm，3 μm)；柱溫30℃；進樣量1 μL；流動相A相為乙腈，B相為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，0～1.0 min 80%～40% B，1.0～4.0 min 40% B，4.0～4.01 min 40%～80% B；流速0.3 mL/min。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描模式，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為10 L/min，毛細管電壓為4 000 V，電噴霧壓力為0.24 MPa。監(jiān)測離子對、源內(nèi)碎裂電壓及碰撞氣能量見表1。

表1 4種AFT的MRM掃描參數(shù)

1.2.3 樣品前處理

稱取1.0 g樣品于塑料離心管中，加入2 mL石油醚溶解，渦旋混勻。再用1 mL乙腈-水(體積比8∶2)混合均勻，超聲萃取2 min，靜置分層后于4 000 r/min離心5 min，吸取底層溶液(為避免上機溶液夾帶油脂污染儀器，再用適量石油醚分兩次反萃取，棄去上層石油醚)經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機。由于沒有購買到標準質(zhì)控樣，每一定量批次樣品選用其中陰性樣品添加已知質(zhì)量濃度的4種AFT溶液作為質(zhì)控。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關系考察

配制的4種AFT的質(zhì)量濃度范圍為0.625～30.0 ng/mL，以質(zhì)譜儀峰面積的響應值(y)對AFT質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，其回歸方程和相關系數(shù)見表2。由表2可知，4種AFT在0.625～30.0 ng/mL范圍內(nèi)的線性良好，線性相關系數(shù)(R2)均大于0.998。

表2 線性關系和線性范圍

2.2 前處理方法的優(yōu)化

根據(jù)文獻不確定度評估分析[19]，對前處理中影響目標物提取效率的因素進行逐項優(yōu)化(包括分散劑的種類和體積、萃取劑的種類和體積、萃取時間、離心轉(zhuǎn)速和離心時間等)。

2.2.1 分散劑、萃取劑及提取方式的篩選

黃曲霉毒素微溶于水，不溶于石油醚、正己烷和乙醚等非極性溶劑，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑。油樣黏稠需使用分散劑稀釋，使萃取劑液滴更好地擴散至樣品與被測物接觸。比較了石油醚、正己烷和乙醚3種分散劑及渦旋與超聲兩種提取方式對AFT回收率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，乙醚為分散劑時AFT回收率低，石油醚和正己烷為分散劑時AFT回收率較高，超聲提取效果略優(yōu)于渦旋。理論上石油醚極性與正己烷相似，為己烷和辛烷等系列烷烴混合物，兩者與油脂互溶性好，利于分散，考慮成本選石油醚作分散劑。超聲波對油脂萃取分離的強化作用主要源于其空化效應，而超聲空化又引起了湍動效應、聚能效應、微擾效應和界面效應，因而超聲波可強化萃取分離過程的傳質(zhì)速率和效果，從而有利于目標物提取。實驗中觀察超聲易形成乳化而增加了溶劑滲透性，配合DLLME過程可提高萃取效率，使目標物易于轉(zhuǎn)入萃取劑而凈化樣品基質(zhì)。

圖1 不同分散劑超聲與渦旋提取對AFT回收率的影響

DLLME用的萃取劑應對分析物有良好的親和性，且有良好的色譜行為。篩選了4種萃取劑(甲醇、乙腈、乙醇和丙酮)，發(fā)現(xiàn)使用乙醇和丙酮為萃取劑時無法分層，實驗中止。使用甲醇-水或乙腈-水為分散劑可增加其在樣品中的滲透力，提高萃取效率。分別考察4種比例(體積比分別為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)的甲醇-水和乙腈-水對AFT回收率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，乙腈-水(體積比8∶2)的AFT整體回收率較高，因此選擇乙腈-水(體積比8∶2)為萃取劑。

圖2 不同比例乙腈-水和甲醇-水為萃取劑對AFT回收率的影響

2.2.2 分散劑體積和萃取劑體積對萃取效果的影響

比較了分散劑體積分別為0、1、2、3、4 mL的萃取效果，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不用分散劑因油樣黏度大難較完全萃取，加入1 mL分散劑明顯優(yōu)化，2 mL的萃取效果比3、4 mL要好。在分散劑增加的過程可能會出現(xiàn)反萃取，且3、4 mL與萃取劑體積(微升級)相差懸殊，不利于溶液分層得到上機液，所以選擇2 mL作為分散劑體積。

比較了萃取劑體積500、800、1 000、1 200 μL的萃取效果，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著萃取劑體積增大萃取效果先增加，但萃取劑體積為1 200 μL時，萃取效果反而降低。可能隨萃取體積增大富集倍數(shù)降低，故選擇萃取劑體積為1 000 μL。

圖3 分散劑體積對AFT回收率的影響

圖4 萃取劑體積對AFT回收率的影響

2.2.3 萃取時間對萃取效果的影響

在石油醚作分散劑(2 mL)、乙腈-水(體積比8∶2)為萃取劑(1 000 μL)等相同條件下，不同超聲輔助萃取時間(2、5、10、15 min)的效果比較見圖5。

圖5 超聲輔助萃取時間對AFT回收率的影響

由圖5可知，超聲2 min時4種黃曲霉毒素回收率均超過85%，延長萃取時間至5 min未見回收率提高，延長至10 min略有降低，再至15 min又稍有增加，原因是隨萃取時間延長會出現(xiàn)反復的反萃取。故選擇超聲輔助萃取2 min，既省時又滿足要求。

2.2.4 離心轉(zhuǎn)速和離心時間對萃取效果的影響

離心可進一步加速溶液分離，提高萃取效率?？疾炝穗x心轉(zhuǎn)速和離心時間分別為2 000、3 000、4 000、5 000 r/min和3、5、8、10 min時的AFT回收率情況，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 離心轉(zhuǎn)速對AFT回收率的影響

圖7 離心時間對AFT回收率的影響

由圖6、圖7可知，離心轉(zhuǎn)速4 000 r/min和離心時間5 min為最佳。

2.3 樣品的加標回收率

采用本方法，用陰性樣品加標做回收率實驗，在2.5、15.0、30.0 ng/mL 3個質(zhì)量濃度水平上進行加標(n=6),同時采用GB 5009.22—2016第一法外標法，用陰性樣品加標做回收率實驗，在30.0 ng/mL質(zhì)量濃度水平上進行加標(n=6)，結(jié)果見表3。由表3可知，采用本方法，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2回收率在88.2%～101.5%之間，在30.0 ng/mL質(zhì)量濃度水平上回收率分別為100.8%、101.0%、99.7%、98.9%。采用國標方法AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在30.0 ng/mL質(zhì)量濃度水平上加標回收率分別為95.1%、94.8%、93.9%、92.9%，本方法在回收率方面優(yōu)于國標第一法外標法，其差異具有統(tǒng)計學意義。且本方法樣品用量少，萃取試劑用量少，時間短，不需要柱凈化和蒸發(fā)濃縮。受條件限制沒有用同位素內(nèi)標法進行校正。

表3 加標回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.4 精密度實驗

以陰性樣品基質(zhì)標準為例，同一標準樣品重復進樣9次，4種AFT的RSD為3.1%～3.3%。

2.5 基質(zhì)效應

用初始流動相稀釋的標準溶液與用陰性花生油和稻米油樣作基質(zhì)配制標準溶液的峰面積做比值，4種AFT的比值在0.95～1.09之間，說明基質(zhì)效應可忽略。因此，本實驗不采取基質(zhì)標準溶液作校正。

2.6 樣品測定

用本方法對市場監(jiān)督抽查的近百批次花生油、米糠油、稻米油、菜籽油和食用調(diào)和油進行檢測，其中一批次陽性花生油樣的總離子流圖見圖8。結(jié)果檢出花生油AFB1和AFB2最高一批次含量分別高達76.8 μg/kg和23.9 μg/kg，AFB1超過限量值近3倍。原因是花生最易在生長、收獲、儲運過程中霉變產(chǎn)毒，再用此花生加工制油時造成黃曲霉毒素污染。其他油樣均未檢出黃曲霉毒素陽性。

圖8 標準和陽性花生油樣品AFT的總離子流圖

3 結(jié) 論

建立了UA-DLLME/RRLC-MS/MS同時測定食用植物油中4種黃曲霉毒素的方法。該方法加標回收率為88.2%～101.5%，相對標準偏差小于3.3%，回收率優(yōu)于國標第一法外標法，且樣品用量少、萃取劑微量、萃取時間短、不需前處理柱凈化和蒸發(fā)濃縮，具有簡單、快速、經(jīng)濟、準確度和精密度高且環(huán)境友好等優(yōu)點，適合批量油樣定性、定量分析，具有實際參考價值。本研究不足之處是提取物可能殘留少許油脂，對色譜柱和儀器污染造成隱患。除了上機前樣液增加脫脂步驟外，建議在色譜柱前加裝預柱。