高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味子糖漿中五味子醇甲及苯甲酸鈉含量

李 玲，趙 猛，王秋實(shí)

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222006）

五味子糖漿處方收載于2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]，由五味子單味藥材經(jīng)加工并添加防腐劑及香精等輔料制成。五味子醇甲為其中主要活性成分[2]，苯甲酸鈉為其中的防腐劑。過(guò)量攝入防腐劑對(duì)人體有一定的毒性，在某些國(guó)家已限制或禁止使用[3]。本研究中參考文獻(xiàn)[4-5]，建立高效液相色譜法同時(shí)對(duì)五味子糖漿中的五味子醇甲和苯甲酸鈉進(jìn)行含量測(cè)定，為提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀，包括2998 二極管陣列檢測(cè)器、Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；BP211D 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Seven Multi 型酸度計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司）；KH-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

五味子糖漿（廣西邦琪藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為171010；太極集團(tuán)四川南充制藥有限公司，批號(hào)為2017006；三門峽廣宇生物制藥有限公司，批號(hào)為170901；上海海虹實(shí)業(yè)集團(tuán)巢湖今辰藥業(yè)有限公司，批號(hào)為180506，180915）；五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)為110857-201815，含量99.7%），苯甲酸鈉對(duì)照品（批號(hào)為100433-201702，含量99.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)pH 至3.0，A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～10 min 時(shí)55%A，10 ～12 min 時(shí)55%A→40%，12 ～35 min 時(shí)40%A）；流速：1.0 mL / min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別稱取待測(cè)成分對(duì)照品各適量，精密稱定，置同一100 mL 容量瓶中，加甲醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，即得五味子醇甲和苯甲酸鈉質(zhì)量濃度分別為0.196 2 mg/mL 和1.190 0 mg/mL 的混合對(duì)照品貯備液；精密量取5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。精密量取樣品5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方和工藝制備缺五味子和苯甲酸鈉的陰性樣品，依法制成陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。理論板數(shù)按五味子醇甲峰和苯甲酸鈉峰計(jì)均不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。

專屬性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照品溶液在與混合對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品貯備液1，2，5，10，15 mL，分別置25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液；精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得五味子醇甲和苯甲酸鈉回歸方程分別為Y1=22 157X1-16 685（r1=0.999 9）和Y2=3 713X2-14 993（r2=0.999 9）。結(jié)果表明，五味子醇甲和苯甲酸鈉質(zhì)量濃度分別在7.85 ～117.70μg/mL 和47.58 ～713.80μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果五味子醇甲和苯甲酸鈉峰面積的RSD分別為0.48% 和0.26%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為180915）適量，分別于室溫下放置0，2，6，12，18 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果五味子醇甲和苯甲酸鈉峰面積的RSD分別為1.45%和0.78%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置18 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（批號(hào)為180915）6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果五味子醇甲和苯甲酸鈉含量的RSD分別為0.56%和0.84%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為180915）5 mL，共6 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品貯備液，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品各適量，分別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3 次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/mL）

3 討論

對(duì)五味子醇甲和苯甲酸鈉進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，五味子醇甲在250 nm 波長(zhǎng)處均有最大吸收，苯甲酸鈉在229 nm 和274 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，苯甲酸鈉在274 nm 波長(zhǎng)處的吸收值與250 nm 相近，故選擇250 nm作為2 種成分的共同檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考藥典方法處理樣品，采用甲醇作為提取溶劑，同時(shí)五味子醇甲和苯甲酸鈉均溶于甲醇，結(jié)果能提取完全；另外，對(duì)比超聲時(shí)間10，20，30 min 對(duì)提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲20 min 后有效成分即能溶出。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定明確了防腐劑在糖漿劑中的使用限量[6]，但并未規(guī)定含量測(cè)定方法。由于防腐劑苯甲酸鈉有一定毒性[3]，目前有些品種口服液已將其作為檢查項(xiàng)加入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，因此同時(shí)檢測(cè)五味子糖漿中的活性成分及防腐劑的含量，不僅簡(jiǎn)化了檢驗(yàn)過(guò)程，而且還可為提高糖漿劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。