高效液相色譜法同時測定醬油中的8種生物胺

伍 鎣 續(xù) 穎 李逸純 柯粵振

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司 廣東中山 528437）

1 前言

生物胺是具有生物活性、含氨基的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為3類：腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等脂肪族胺；酪胺、苯乙胺等芳香族胺；組胺、色胺等雜環(huán)胺。生物胺由原料中的酶或者微生物代謝產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用產(chǎn)生，是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分，它們在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面具有重要作用，但攝入過量會引起頭痛、呼吸紊亂、血壓變化、心悸等過敏性反應(yīng)和癥狀，嚴(yán)重時可引起大腦內(nèi)出血，甚至死亡。

生物胺廣泛存在于食品中，尤其是釀造醬油、酒類等發(fā)酵食品中[1]，主要有8種：色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺，其中組胺與酪胺對人類健康影響最大[2]。醬油主要是由大豆/脫脂大豆、小麥、面粉及麩皮等多種原料在不同的微生物作用下發(fā)酵而成，且具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[3]。在醬油的發(fā)酵過程中，各種微生物在不同酶系作用下，與原料中各種有機(jī)物發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)。其中，原料中富含的蛋白質(zhì)在蛋白酶和肽酶的相繼作用下，經(jīng)一系列水解過程生成各種肽及氨基酸。由于含有相對較高含量的氨基酸以及多種微生物，因此醬油在長期發(fā)酵過程中很容易產(chǎn)生生物胺，導(dǎo)致醬油存在潛在的不安全性。有研究顯示，在已檢測過的醬油中普遍存在生物胺，有個別醬油中的總生物胺含量甚至超過了1 000 mg/kg[4-6]。醬油是我國以及亞洲廣泛食用的液體調(diào)味品，在人們的日常飲食中占據(jù)著重要地位，對醬油整個發(fā)酵過程的中間產(chǎn)物即天然油中生物胺的含量和變化規(guī)律進(jìn)行研究十分重要，因此，需要建立有效準(zhǔn)確的醬油中生物胺的檢測方法。

目前，檢測生物胺含量的常用方法有：高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等，其中，最普遍的方法是高效液相色譜法。但不同研究中采用高效液相色譜法進(jìn)行生物胺分析時，由于樣品種類不同，設(shè)定的色譜條件也互不相同。因此，本文從流動相選擇、梯度洗脫設(shè)置、柱溫等對色譜條件進(jìn)行探討和優(yōu)化，確立了同時測定8種生物胺含量的最佳高效液相色譜法色譜條件，以滿足醬油中8種生物胺含量測定的要求。

2 試驗部分

2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相-紫外檢測器；渦旋振蕩器；水浴鍋；氮吹儀；天平：感量為0.000 1 g；超純水儀。

試劑：組胺鹽酸鹽；β-苯乙胺鹽酸鹽；酪胺鹽酸鹽；腐胺鹽酸鹽；尸胺鹽酸鹽；色胺鹽酸鹽；精胺鹽酸鹽；亞精胺鹽酸鹽；1，7-二氨基庚烷；丹磺酰氯（純度＞99%）；乙腈（色譜純）；丙酮、乙醚、谷氨酸鈉（色譜純）；碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（分析純）；鹽酸（優(yōu)級純）。

2.2 試驗過程

2.2.1 樣品預(yù)處理

吸取1.0 mL醬油樣品于50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線。

2.2.2 樣品衍生化

準(zhǔn)確吸取1.0 mL稀釋后的樣液置于15 mL塑料離心管中，依次加入250 μL 1，7-二氨基庚烷內(nèi)標(biāo)溶液（100 mg/L）、1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、1 mL丹磺酰氯衍生試劑，渦旋混勻1min后置于60℃恒溫水浴鍋中衍生15min。取出離心管后，分別向其中加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，在60℃恒溫條件下反應(yīng)15 min，取出冷卻至室溫，在每個離心管中加入1 mL超純水，渦旋混合1 min，在40℃水浴下氮吹除去丙酮（樣液約減少1 mL）。然后加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至完全溶解，再向其中加入5 mL乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相(乙醚層)于15 mL試管中，下層（水相）再次進(jìn)行萃取，合并2次乙醚萃取液，在40℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，用0.22 μm 濾膜針頭濾器過濾，待測。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制濃度為 1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL含有不同濃度的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL具塞試管中，依次加入250 μL 1，7-二氨基庚烷內(nèi)標(biāo)溶液（100 mg/L），具體操作同2.2.2。

2.2.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（柱長250mm，柱內(nèi)徑4.6mm，柱填料粒徑5 μm）；紫外檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃；流速：1mL/min。流動相 A：0.1mol/L乙酸銨；流動相 B：乙腈；梯度洗脫：0~5 min，40%A→30%A；5~15 min，30%A→0%A；15~25 min，0%A。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件及衍生化過程的選擇

試驗過程中分別選用了有機(jī)相乙腈和甲醇與乙酸銨、乙酸等溶液搭配使用來選擇合適的流動相，試驗結(jié)果顯示，乙腈和乙酸銨搭配使用分離效果最好。試驗選用了梯度洗脫縮短檢測時間并消除醬油中復(fù)雜物質(zhì)的干擾，同時觀察到柱溫變化時出峰順序沒有發(fā)生變化，但分析時間隨柱溫的升高而縮短。

由于醬油中氨基酸、糖類與生物胺等與丹磺酰氯參與衍生化反應(yīng)的物質(zhì)含量較高，容易導(dǎo)致衍生化反應(yīng)不完全，通過試驗確定，對樣品稀釋50倍后再進(jìn)行測定，衍生化反應(yīng)效果良好。

3.2 線性范圍與檢出限

在1~50 mg/L內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，8種生物胺相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999。選取加入低濃度的加標(biāo)樣品進(jìn)行試驗，通過標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）評估方法得到色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的方法檢出限分別為：4.1、4.8、3.6、9.0、3.8、1.6、8.4、8.1 mg/L。

3.3 精密度試驗

取8種生物胺均為陽性的醬油作為樣本，搖勻后分別吸取1.0 mL醬油樣品于50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，進(jìn)行6次平行試驗，結(jié)果詳見表1。

從表1可知，在生物胺含量測定平行試驗中，色胺、β-苯乙胺、尸胺、組胺、亞精胺與精胺的平行試驗結(jié)果變異系數(shù)（RSD）均小于5.3%，腐胺與酪胺的平行試驗結(jié)果變異系數(shù)均小于3.8%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[7]中平行測定結(jié)果的變異系數(shù)要求，本次平行試驗結(jié)果符合精密度要求。

4 結(jié)論

本研究以0.1 mol/L乙酸銨和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，丹磺酰氯衍生，在35 min內(nèi)使8種生物胺完全分離。該方法重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確測定醬油中不同濃度水平的8種生物胺含量，滿足對醬油發(fā)酵過程生物胺含量變化的監(jiān)測。