微波結(jié)合真菌發(fā)酵液輔助水蒸氣蒸餾法提取馬來沉香揮發(fā)油的工藝優(yōu)化

陳興靜，楊思惠，吳勝鴻，黃圓圓，章衛(wèi)民，陳曉穎，高曉霞

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省微生物研究所華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣東 廣州 510070)

沉香是名貴的藥材和天然香料，為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)植物含有樹脂的木材[1]。目前發(fā)現(xiàn)的沉香屬21種植物中，主要用于產(chǎn)香的是A.sinensis(Lour.) Gilg.、A.malaccensisLamk.(syn.A.agallochaRoxb.[2])、A.subintegraDing Hou、A.crassnaPierre等[3-4]，由A.malaccensis產(chǎn)生的沉香稱之為馬來沉香。沉香的主要有效成分是沉香揮發(fā)油，以倍半萜和芳香族化合物為主[5]，其中倍半萜類化合物主要包括愈創(chuàng)木醇、沉香螺醇、γ-桉葉油醇等，芳香族化合物主要包括芐基丙酮、茴香基丙酮等[6-9]。

沉香揮發(fā)油提取方法主要有水蒸氣蒸餾[10]、溶劑提取[11]和CO2超臨界流體萃取[12]等方法。水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油品質(zhì)好，但耗時長、提取率低；溶劑提取所得的揮發(fā)油含2-(2-苯乙基)-色酮類等較高沸點的成分較多，得油率較高，但易殘留有機溶劑，油品質(zhì)稍差；CO2超臨界流體萃取無溶劑殘留，但成本昂貴，且含油蠟質(zhì)等雜質(zhì)，需再次精制[13]。為提高沉香揮發(fā)油提取率，已有報道采用微波輔助[14]、酶輔助[15]及內(nèi)生真菌發(fā)酵[16]輔助溶劑法提取，還有學(xué)者采用酶結(jié)合微波輔助溶劑法提取[17]。關(guān)于水蒸氣蒸餾法提取沉香揮發(fā)油的輔助方法，本課題組前期通過微波、酶解、內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡等輔助方法對水蒸氣蒸餾法提取馬來沉香揮發(fā)油化學(xué)組成的影響進行了研究[18]，本研究采用無溶劑微波和白木香內(nèi)生真菌BotrysphaeriarhodinaA13發(fā)酵液浸泡沉香粗粉后通過水蒸氣蒸餾法提取馬來沉香揮發(fā)油，正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝條件，以期提高沉香揮發(fā)油提取率、降低成本，為水蒸氣蒸餾法提取沉香揮發(fā)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 試藥與儀器

供試品、真菌發(fā)酵液均與文獻[18]相同，供試品為瑞香科植物馬來沉香A.malaccensisLamk.即A.agallochaRoxb.，符合進口沉香藥材的質(zhì)量標準[19]，真菌發(fā)酵液BotrysphaeriarhodinaA13[20]由廣東省微生物研究所李浩華高級實驗師鑒定并提供。

乙醚(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；正構(gòu)烷烴混合對照品C7～C40(色譜純，美國AccuStandard公司，DRH-008S-R2)。

Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；PYX-250G-B智能編程光照培養(yǎng)箱(廣東省韶關(guān)市科力實驗儀器有限公司)；WBFY-205微波化學(xué)反應(yīng)器(河南省鞏義市予華儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市宏華儀器廠)；JA2003A電子天平(萬分之一，上海精天電子儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油乙醚萃取液GC-MS分析

2.1.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：260 ℃；載氣：高純度氦氣；流速：1.0 mL/min；進樣量：1.0 μL，不分流進樣；升溫程序：90 ℃，保溫4 min，以1.5 ℃/min升溫至130 ℃，保溫20 min后以0.5 ℃/min升溫至160 ℃，保溫5 min后以1 ℃/min升溫至180 ℃，保溫5 min后以2 ℃/min升溫至230 ℃，保溫30 min。

調(diào)諧方式：標準調(diào)諧方式；離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；電離電壓：1.0 kV；接口溫度：240 ℃；質(zhì)量掃描范圍：45～500 m/z，溶劑延遲時間：5 min。

2.1.2 真菌發(fā)酵液水蒸氣蒸餾乙醚萃取液制備 取B.rhodinaA13發(fā)酵液40 mL置250 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水10 mL，搖勻，置揮發(fā)油測定器中加熱回流4 h，停止加熱，靜置片刻。將揮發(fā)油提取裝置油水分離器中的液體轉(zhuǎn)移至30 mL分液漏斗，加入乙醚4 mL，振搖提取2 min，靜置分層，取上層溶液于5 mL量瓶中，用乙醚定容至刻度，搖勻后倒至蒸發(fā)皿中，35 ℃水浴加熱揮干溶劑，用少量乙醚溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加乙醚定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 水蒸氣蒸餾乙醚萃取液制備 精密稱定5.00 g 沉香粗粉(過2號篩，且不過3號篩)，置250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL水，充分振蕩搖勻后，靜置12 h。搖勻，自“置揮發(fā)油提取裝置中加熱回流4 h”起按“2.1.2”項操作，即得。

2.1.4 微波聯(lián)合真菌發(fā)酵液浸泡輔助水蒸氣蒸餾乙醚萃取液制備 精密稱定5.00 g沉香粗粉(過2號篩，且不過3號篩)，置100 mL具塞錐形瓶中，少量蒸餾水潤濕后以微波功率300 W加熱，然后加入B.rhodinaA13發(fā)酵液，搖勻，密封，35 ℃恒溫浸泡，用水轉(zhuǎn)移至250 mL圓底燒瓶，并加水補齊至50 mL溶液體積，搖勻，自“置揮發(fā)油提取裝置中加熱回流4 h”起按“2.1.2”項操作，即得。

2.2 單因素試驗

2.2.1 粉碎粒徑的考察 精密稱定5.00 g樣品3份，其中2份按2015年版《中國藥典》規(guī)定分別制成過2號篩且不過3號篩、過3號篩的粗粉，另1份保持不變，固定發(fā)酵液浸泡時間12 h、料液比1∶10、提取時間4 h、微波2 min，按“2.1.2”項下方法提取揮發(fā)油，按“2.1.1”項下方法測得過2號篩且不過3號篩沉香粗粉出峰數(shù)多，總峰面積高。雖然藥材粒徑變小，表面積增大，溶劑滲入好，擴散速度加快，有利于有效成分的擴散，但是，隨著粉碎程度不斷增加，顆粒表面的揮發(fā)性成分易逸失，因此本文選擇過2號篩且不過3號篩的粗粉作為粒徑。

2.2.2 提取時間的考察 精密稱定5.00 g沉香粗粉2份，固定發(fā)酵液浸泡時間12 h、料液比1∶10、微波2 min，分別進行水蒸氣蒸餾提取4、8 h，結(jié)果表明提取2～4 h時出現(xiàn)黃色油滴，之后揮發(fā)油的油量增加不明顯，說明揮發(fā)油基本提取完全，同時不同提取時間乙醚萃取液GC-MS總峰面積無差異，為節(jié)約時間，本文選擇4 h作為水蒸氣蒸餾提取時間。

2.2.3 真菌發(fā)酵液浸泡時間的考察 精密稱定5.00 g樣品粗粉6份，固定料液比1∶10、微波2 min、提取時間4 h，真菌發(fā)酵液于35 ℃恒溫(基于沉香主產(chǎn)區(qū)東南亞氣候條件)分別浸泡12 h和1、2、3、4、5 d，隨著浸泡時間的延長，4 d所得揮發(fā)油乙醚萃取液的GC-MS總峰面積最大，且超過4 d觀察到浸泡液變質(zhì)的現(xiàn)象，故正交試驗選擇1、2、3、4 d進行考察。

2.2.4 料液比的考察 精密稱定5.00 g樣品粗粉6份，固定發(fā)酵液浸泡時間12 h、微波2 min、提取時間4 h，分別考察料液比1∶1、1∶4、1∶5、1∶6、1∶10、1∶12，蒸餾30 min左右出現(xiàn)黃色油滴，料液比為1∶6時乙醚萃取液的總峰面積最高，故正交試驗選擇1∶2、1∶4、1∶6、1∶8進行考察。

2.2.5 微波輔助萃取時間的考察 固定發(fā)酵液浸泡時間12 h、料液比1∶6、提取時間4 h，微波輔助時間40 s和1.5、2、3 min，蒸餾30 min左右出現(xiàn)黃色油滴，當微波輔助萃取時間大于等于3 min時，于空氣中聞到沉香特有的芳香氣味，提示沉香特征性成分的逸失，且1.5 min時總峰面積最大，故微波輔助時間選擇0、1、1.5、2 min進行考察。

2.3 正交試驗優(yōu)化提取工藝

2.3.1 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵液浸泡時間(A)、料液比(B)、微波加熱時間(C)3個因素進行考察，每個因素設(shè)計4個水平，以乙醚萃取液GC-MS總峰面積、總倍半萜類化合物峰面積和總芳香族化合物峰面積作為考察指標，設(shè)計L16(43)正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

注：料液比為樣品原料質(zhì)量與發(fā)酵液體積之比。

按“2.1.2”項下制備的真菌發(fā)酵液水蒸氣蒸餾乙醚萃取液經(jīng)GC-MS分析，出峰數(shù)為23個，總峰面積為1.09×108，共檢出4個色譜峰，檢出化合物質(zhì)量分數(shù)最高的是芳香族化合物苯乙醇(21.03%)，其中僅含有少量與沉香水蒸氣蒸餾萃取液共有的芐基丙酮(0.83%)(圖1A)。按“2.1.3”項下制備的直接水蒸氣蒸餾法乙醚萃取液經(jīng)GC-MS分析，出峰數(shù)為97個，總峰面積為2.05×109，共檢出30個色譜峰，檢出物總質(zhì)量分數(shù)為59.23%，總芳香族質(zhì)量分數(shù)為0.20%，總倍半萜質(zhì)量分數(shù)為58.83%(圖1B)。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

6718755499441133211571647904197028.3656.7285.08113.44141.80170.16198.52豐度CBAt/min

A.B.rhodinaA13發(fā)酵液； B.馬來沉香； C.微波結(jié)合B.rhodinaA13發(fā)酵液浸泡馬來沉香。

圖1水蒸氣蒸餾揮發(fā)油乙醚萃取液GC-MS總離子流圖

Figure1TIC of GC-MS in ether extract of steam distillation volatile oil

微波輔助聯(lián)合真菌發(fā)酵液浸泡水蒸氣蒸餾法正交試驗16個樣品經(jīng)GC-MS分析，出峰數(shù)分別為182、171、167、220、158、154、168、169、164、154、153、168、162、153、164、159，總峰面積為1.79×109～7.59×109。共檢出33個色譜峰，檢出峰峰面積占總峰面積的比值(%)分別為69.10、68.39、67.99、59.58、68.27、69.47、63.98、61.48、65.87、67.82、67.62、60.92、68.36、67.71、66.06、64.11，其中總芳香族化合物的質(zhì)量分數(shù)為0.77%～1.43%，總倍半萜為58.48%～68.31%，質(zhì)量分數(shù)較高的化合物是喇叭醇(9.08%～13.34%)、γ-桉葉油醇(7.76%～11.45%)、6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-naphthalen-2-ol(6.29%～7.68%)、馬兜鈴烯(4.17%～5.31%)和沉香螺醇(2.97%～3.93%)。

微波輔助聯(lián)合B.rhodinaA13發(fā)酵液浸泡水蒸氣蒸餾在不同工藝條件下所得萃取液出峰數(shù)變化較大，總峰面積為直接用水蒸氣蒸餾法的0.87～3.70倍。以正交試驗設(shè)計中總峰面積最高的15號樣品為例(圖1C)，出峰數(shù)為164個，總峰面積為7.59×109，為直接水蒸氣蒸餾法的3.70倍，共檢出33個色譜峰，檢出物峰面積占總峰面積的66.06%，總芳香族質(zhì)量分數(shù)為1.09%，總倍半萜質(zhì)量分數(shù)為64.53%，2-(2-苯乙基)色酮類化合物質(zhì)量分數(shù)為0.09%。

2.3.3 正交試驗結(jié)果分析 由表2正交試驗結(jié)果直觀分析可見，影響因素主次順序為發(fā)酵時間>微波時間>料液比，各因素的水平影響順序為：A4>A2>A3>A1、B4>B3>B1>B2、C1>C2>C4>C3；另外，從表3方差分析結(jié)果可見，發(fā)酵液浸泡時間(A)對沉香揮發(fā)油提取有顯著影響(P<0.05)，料液比(B)與微波時間(C)無明顯影響。綜合以上分析，確定最佳組合為A4B4C1，即沉香揮發(fā)油最佳提取工藝條件為發(fā)酵液浸泡4 d，料液比為1∶8，微波0 min。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.3.4 驗證試驗 以微波2 min方法(發(fā)酵液浸泡4 d，料液比為1∶8，微波2 min)為參照，采用優(yōu)化工藝(發(fā)酵液浸泡4 d、料液比1∶8、微波0 min)進行驗證試驗，結(jié)果表明微波2 min方法總峰面積平均值為2.73×109(n=3，RSD為5.68%)，優(yōu)化工藝的樣品(n=3)總峰面積分別為0.97×1010、1.01×1010、1.09×1010，峰面積RSD為5.97%，為微波2 min方法的3.55～3.99倍。

3 討論

3.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的選擇

Fazila等[21]采用乳酸浸泡馬來沉香可將揮發(fā)油的提取量從1.72%提升到4.74%。Monggoot等[22]用Lactobacillusbulgaricus、Streptococcusthermophilus、Saccharomycescarlsbergensis等培養(yǎng)液浸泡沉香(A.subintegraDing Hou.)粉末可提高水蒸氣蒸餾法的提取率，經(jīng)GC-MS分析主要成分為β-沉香呋喃、α-桉葉油醇、卡拉酮、α-沉香呋喃和沉香螺醇，推測是由于微生物的胞外酶活性引起的提取率增加。B.rhodinaA13為分離自白木香結(jié)香部位的內(nèi)生真菌[20]，離體和在體誘導(dǎo)白木香試驗結(jié)果表明，該真菌可高效誘導(dǎo)白木香形成沉香組分[23-28]。B.rhodinaA13誘導(dǎo)離體白木香枝條可形成5,9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇等倍半萜類化合物[23]；以白木香木屑為培養(yǎng)基接種B.rhodinaA13培養(yǎng)后從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基 -2-(2-苯乙基)色酮等2-(2-苯乙基)色酮類次生代謝產(chǎn)物[24]；B.rhodinaA13誘導(dǎo)白木香樹后，隨著造香時間的增加，結(jié)香部位的醇溶性浸出物和芐基丙酮的含量均有增加[27]；甲酸結(jié)合B.rhodinaA13誘導(dǎo)白木香12個月可形成白木香醛、長馬鞭草烯酮、古蕓烯氧化物、愈創(chuàng)木醇、5，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮等沉香特征性成分[28]。基于此，本研究選擇B.rhodinaA13發(fā)酵液浸泡馬來沉香輔助提取揮發(fā)油。

與未經(jīng)真菌發(fā)酵液處理的水蒸氣蒸餾提取法相比，微波輔助聯(lián)合B.rhodinaA13發(fā)酵液浸泡處理后水蒸氣蒸餾提取馬來沉香揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分析，化合物種類明顯增加，出峰數(shù)從97個增至220個色譜峰，新檢出2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮和6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮等沉香特征性成分。B.rhodinaA13發(fā)酵液浸泡處理可提高沉香揮發(fā)油提取率，且其發(fā)酵液中苯乙醇、對羥基苯丙酸等主要次生代謝產(chǎn)物未在沉香揮發(fā)油萃取液中檢測到，提取率的提高可能由B.rhodinaA13分泌的酶活性引起，這方面尚有待進一步研究。

3.2 正交試驗評價指標選擇與優(yōu)化

受樣品量所限，本研究所制得的沉香揮發(fā)油無法收集或讀取體積，因而采用乙醚萃取液進行GC-MS分析。水蒸氣蒸餾法提取的馬來沉香揮發(fā)油以倍半萜和芳香族化合物為主，芐基丙酮、δ-愈創(chuàng)木烯、α-愈創(chuàng)木烯、沉香螺醇、γ-桉葉油醇、欖香醇為主要成分[6,21]。Ismail等[8]認為沉香揮發(fā)油的主要成分是倍半萜類化合物，其化學(xué)組成是沉香揮發(fā)油分級的主要參考依據(jù)，而本研究馬來沉香經(jīng)內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡處理后水蒸氣蒸餾提取的沉香揮發(fā)油中總倍半萜化合物的質(zhì)量分數(shù)在58.58%～67.58%，符合沉香揮發(fā)油的成分特征。但是，目前尚無如沉香螺醇等與沉香揮發(fā)油品質(zhì)密切相關(guān)的倍半萜類化合物的對照品，因此無法建立適宜的含量測定方法。課題組前期工作中建立了沉香藥材中特征性成分芐基丙酮的含量測定方法[27]，在本文中建立了沉香揮發(fā)油乙醚萃取液中芐基丙酮的含量測定方法，并且對文中16個試驗樣品進行了測定，將芐基丙酮含量與總峰面積進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者無相關(guān)性，即芐基丙酮的含量與沉香揮發(fā)油提取出的化合物相對總量不相關(guān)。在工藝考察研究中，相同條件下獲得的GC-MS色譜峰面積可間接體現(xiàn)揮發(fā)油提取量，16個正交試驗樣品總峰面積1.79×109～7.59×109之間，為直接水蒸氣蒸餾法的0.87～3.70倍，差異明顯。因此，本文選擇總峰面積、倍半萜、芳香族化合物總峰面積作為考察指標。

課題組前期工作中，關(guān)于不同輔助提取方法提取馬來沉香揮發(fā)油化學(xué)組成分析結(jié)果表明，發(fā)酵液浸泡3 d、料液比1∶5、微波2 min時水蒸氣蒸餾法總峰面積3.31×109，為直接的真菌發(fā)酵液浸泡輔助方法的1.57倍，出峰數(shù)從111個色譜峰下降為103個色譜峰[18]。本文正交試驗結(jié)果表明，發(fā)酵液浸泡時間對沉香揮發(fā)油提取有顯著影響(P<0.05)，經(jīng)驗證試驗表明，最佳工藝條件下即直接的真菌發(fā)酵液浸泡輔助方法，為相同條件下微波2 min輔助聯(lián)合方法的3.55～3.99倍，出峰數(shù)從89個色譜峰上升為116個色譜峰。與直接的水蒸氣蒸餾法、微波聯(lián)合內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助方法相比，內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡輔助水蒸氣蒸餾法提取沉香揮發(fā)油簡便、經(jīng)濟、環(huán)保、提取效率高，可為水蒸氣蒸餾法提取沉香揮發(fā)油的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

致謝：文中所用沉香樣品由吳光明先生提供。