銀杏葉對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡、bcl-2和Bax表達(dá)的影響

缺血再灌注是大多數(shù)缺血性腦血管疾病的主要病理過程，壞死主要以損傷缺血中心區(qū)為主，神經(jīng)細(xì)胞凋亡主要以損傷在邊緣區(qū)為主，其中邊緣區(qū)的神經(jīng)元死亡直接影響病人腦梗死的體積[1-2]。所以在臨床上要盡量減少邊緣區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，使腦梗死的范圍減少，使梗死程度降低。目前認(rèn)為，bcl-2和Bax與神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)研究銀杏葉對(duì)腦缺血再灌注后損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡、bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的合格健康雌性SD大鼠40只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)20140009，體質(zhì)量175～220(210.43±17.02)g，

1.1.2 試劑與儀器 試劑：Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG生產(chǎn)的(商品名：金納多，批準(zhǔn)文號(hào)：H20090296)，銀杏葉提取物片( 金納多)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)TTC(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride)，德國(guó)默克公司生產(chǎn)的TUNEL 凋亡試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的bcl-2、Bax 抗體、ECL 顯色試劑盒。儀器：日本Sony公司生產(chǎn)的Sony 數(shù)碼相機(jī)，日本尼康公司生產(chǎn)的50i 熒光顯微鏡， Tanon 4500SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)和GIS 1D分析軟件是由上海天能科技有限公司生產(chǎn)的。

1.2 方法

1.2.1 分組與動(dòng)物建模 將40組大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組， 每組10只。取銀杏葉，粉碎，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，合并提取液并且搖勻，配置為不同濃度，濃度5 g/L為低劑量組，濃度10 g /L為高劑量組，對(duì)大鼠的灌胃劑量為1 mL/100 g，1次/日，假手術(shù)組和模型組灌胃劑量為0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥10 d，30 min后造模。依據(jù)Longa等[4]的大鼠大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷法，對(duì)大腦進(jìn)行阻塞，1 h后，再進(jìn)行灌注，除假手術(shù)組的大鼠不進(jìn)行插線栓塞外，各實(shí)驗(yàn)組其余處理方法一致，造模1 d后，斷頭取腦組織。

1.2.2 檢測(cè)方法 ①bcl-2 和Bax 蛋白檢測(cè)：每組取3只大鼠，檢測(cè)方法采用Western blot方法，用劑量為10 mL/g組織裂解液裂解大鼠的腦組織，進(jìn)行離心(4 ℃，14 000 r /min)，10 min后， 提取上清液，加入BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，在100 ℃變性10 min，分裝在-80 ℃保存，每孔20 μL，聚丙烯酰胺凝膠電泳(設(shè)定參數(shù)：恒定電流80 mA)后將聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)于PVDF膜上，洗滌后，用5% 脫脂奶粉封閉放置于室溫環(huán)境1 h，再加入bcl-2和Bax抗體放于4 ℃環(huán)境過夜，第2天進(jìn)行搖洗，再加入bcl-2和Bax抗體，繼續(xù)放置于37 ℃環(huán)境1 h，再次洗滌后，進(jìn)行ECL顯影，最后利用圖像分析軟件對(duì)光密度條帶值進(jìn)行測(cè)定[5]。②細(xì)胞凋亡檢測(cè)：4組各取4只大鼠，斷頭處死并解剖取出腦組織，嚴(yán)格按照TUNEL 凋亡試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，出現(xiàn)明亮綠色信號(hào)即為凋亡的細(xì)胞，每份標(biāo)本取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。③腦梗死體積百分比測(cè)定：每組取3只大鼠，在距離額極2 mm處向后取5個(gè)腦片，切取時(shí)注意等距離，放置于37 ℃避光的環(huán)境下進(jìn)行TTC染色，持續(xù)10 min，染色后若是梗死的腦組織呈現(xiàn)白色，樣本放置于10%甲醛固定24 h，照相機(jī)攝片后采用Tanon 4500SF全自動(dòng)數(shù)碼凝膠化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)和GIS 1D分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比[6]。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積百分比、凋亡細(xì)胞數(shù)比較 假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)腦梗死和凋亡細(xì)胞，模型組大鼠的腦梗死無論在體積百分比、凋亡細(xì)胞數(shù)都明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；低劑量組、高劑量組梗死體積的百分比和凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組，且高劑量組大鼠腦梗死體積百分比、凋亡細(xì)胞數(shù)較低劑量組降低顯著(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注24 h 后腦梗死體積百分比、凋亡細(xì)胞數(shù)比較(±s)

1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<

0.05；3)與低劑量組比較，P<0.05

2.2 各組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比較 模型組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax表達(dá)遠(yuǎn)高于假手術(shù)組(P<0.05)，低劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax顯著高于模型組的大鼠，而Bax低于模型組的大鼠，高劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax表達(dá)高于模型組的大鼠，而Bax低于模型組，且高劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2/Bax高于低劑量組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比較(±s)

1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<0.05；3)與低劑量組比較，P<0.05

3 討 論

神經(jīng)元死亡的主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡是由于腦缺血再灌注后所產(chǎn)生氧自由基、炎癥因子誘發(fā)而引起的[7]。實(shí)驗(yàn)研究表明：腦缺血再灌注造模的大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)較假手術(shù)處理的大鼠顯著增多，且出現(xiàn)明顯的梗死灶，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。目前臨床上關(guān)于腦缺血再灌注神經(jīng)凋亡的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但是在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)凋亡與bcl-2和Bax兩個(gè)蛋白的表達(dá)相關(guān)，前者抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，后者促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8]。有研究顯示：bcl-2蛋白在惡性腫瘤病人中表達(dá)顯著，對(duì)臨床上抗腫瘤治療的效果產(chǎn)生影響，而Bax蛋白表達(dá)后膜相關(guān)蛋白能促進(jìn)細(xì)胞的死亡，作用效果強(qiáng)烈，Bax蛋白表達(dá)后使得線粒體的通透性增加，進(jìn)而釋放Cytc 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，Caspase-3被激活后造成細(xì)胞的凋亡，并且在細(xì)胞內(nèi)bcl-2和Bax表達(dá)的兩種蛋白相互作用形成的二聚體對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能具有調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為抑制或者促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高劑量組大鼠的bcl-2/Bax值較模型組顯著升高，提示銀杏葉對(duì)于bcl-2、Bax表達(dá)具有顯著的影響，可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，降低腦損傷，可能是由于銀杏葉含有能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)的氧化成分黃酮、銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)[11]。本實(shí)驗(yàn)顯示：灌喂銀杏葉提取物的大鼠腦梗死體積百分比、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著下降，尤其是高劑量灌喂的大鼠梗死體積百分比、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)下降差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在bcl-2、Bax表達(dá)方面，銀杏葉灌喂的大鼠bcl-2表達(dá)增加，而Bax表達(dá)減少，但與劑量無關(guān)，高劑量灌喂的大鼠bcl-2/Bax值高于低劑量大鼠，高劑量灌喂銀杏葉對(duì)于抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用更為顯著，這與張鴻等[12]、牟芳芳等[13]學(xué)者的研究一致。

綜上所述，銀杏葉治療缺血再灌注損傷大鼠能有效抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、減少腦梗死體積百分比，高劑量用藥更顯著，可增加腦缺血再灌注24 h后bcl-2的表達(dá)，降低Bax表達(dá)，對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但是對(duì)于bcl-2和Bax表達(dá)與劑量無關(guān)。