驢源馬腺疫鏈球菌的分離與鑒定

朱曼玲，齊鵬飛，黃迪海，王長法，張 燕，4，張 偉

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅蘭州 730070；3.聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東聊城 252000；4.山東農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山東濟南 250100）

腺疫是一種常見的馬屬動物疫病，是由馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equisubsp.equi，S.equi）經(jīng)口鼻感染后引起的。易感的馬屬動物可通過直接接觸感染，或通過人、物品和環(huán)境等媒介間接感染馬鏈球菌[1]。由馬鏈球菌馬亞種引起的疾病是世界范圍內(nèi)最常見、最重要的馬屬動物傳染性疾病之一。S.equi具有很強的傳染性，引起的發(fā)病率可能很高，但導致的死亡率通常較低。S.equi感染的臨床癥狀嚴重程度，因上呼吸道病癥表現(xiàn)而異，多數(shù)表現(xiàn)為急性發(fā)熱并發(fā)咽炎，隨后下頜和咽后淋巴結(jié)形成膿腫，并伴有大量黏液性、膿性鼻分泌物；罕見的潛在致命并發(fā)癥包括急性呼吸困難、吞咽困難和免疫反應。大多數(shù)馬屬動物感染S.equi后在幾周內(nèi)就會痊愈，然而大約有10%的馬屬動物會成為慢性的、病菌長期滯留體內(nèi)的攜帶者[2]。

目前，關于S.equi感染驢的報道較少。本研究對2019 年5 月發(fā)生在山東省某驢養(yǎng)殖場的腺疫疫情進行了S.equi檢測和敏感藥物篩選，可為驢腺疫的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料

無菌采集2頭病驢的頜下淋巴結(jié)腫脹化膿液。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯瓊脂平板、5%綿羊鮮血平板、TSB培養(yǎng)基，2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、DL 2 000 bp DNA Master：購自北京天根生化科技有限公司；鏈球菌生化鑒定試劑盒和鏈球菌生化編碼鑒定手冊：購自杭州天和微生物試劑有限公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit：購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離純化與染色鏡檢 將無菌采集的膿液，分別劃線接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板和5%綿羊鮮血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)穩(wěn)定一致。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。

1.3.2 生化鑒定 將分離菌接種于鏈球菌生化鑒定試劑盒，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后加入指示劑，觀察結(jié)果。根據(jù)鏈球菌生化編碼鑒定手冊進行鑒別分析，認定指數(shù)接近100 為可靠結(jié)果[3]。

1.3.3 藥敏試驗 采用紙片擴散K-B 法進行藥敏試驗：挑取單個菌落接種于5 mL TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h；用無菌PBS 緩沖液稀釋菌液，使其在600 nm 波長的吸光度為0.1；將稀釋后的菌液均勻涂布于HM 固體培養(yǎng)基表面，每塊培養(yǎng)基貼4 個紙片，37 ℃培養(yǎng)18 h 后，量取抑菌圈直徑，重復3 次，計平均值。參照美國臨床和實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）藥敏結(jié)果判定標準（2013 版）進行結(jié)果判定。

1.3.4 分離菌16S rDNA PCR 測序（1）PCR模板制備。挑取分離株純培養(yǎng)單菌落，用TSB培養(yǎng)基增菌后，用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit 提取菌液DNA。（2）16S rDNA PCR擴增。細菌16S rDNA 的通用引物序列為F27：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；R1492：5'-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。欲擴增片段大小約為1 500 bp。上述引物由北京擎科生物科技有限公司合成。反應體系（25 μL）為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板1.5 μL；反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃變性40 s、56 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。（3）測序比對分析。將單一目的條帶PCR 產(chǎn)物，送華大基因股份有限公司測序，并將測序結(jié)果通過Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在GenBank 中進行比對，用DNAstar 軟件構(gòu)建Blast 比對結(jié)果相關基因的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)

從2 只病驢頜下淋巴結(jié)腫脹化膿液中分離到2 株菌，分別命名為M1、M2。分離菌為革蘭氏染色陽性的彎曲長鏈條球菌（圖1）。2 株菌在營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上生長不良；在5%綿羊鮮血平板上發(fā)生β 型溶血（圖2），在露珠狀小菌落周圍形成完全透明的溶血帶；TSB 培養(yǎng)16 h 后，發(fā)現(xiàn)試管底有少量菌體，經(jīng)劇烈搖動才能使培養(yǎng)基混濁。

圖1 馬鏈球菌革蘭氏染色形態(tài)

圖2 馬鏈球菌在鮮血平板上發(fā)生β 型溶血

2.2 生化鑒定

經(jīng)生化鑒定，判定M1 和M2 均為馬鏈球菌（認定指數(shù)為0.98，尚需鑒別）。生化鑒定結(jié)果見表1。

2.3 藥物敏感性分析

紙片藥敏性試驗結(jié)果顯示，2 株分離菌對12 種抗菌藥中的4 種（氨芐西林、卡那霉素、甲氧氨芐嘧啶和四環(huán)素）產(chǎn)生了較強的耐藥性，但對恩諾沙星、氯霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和美羅培南高度敏感（表2）。

表1 2 株菌（M1、M2）的生化鑒定結(jié)果

表2 2 株菌（M1、M2）的藥敏試驗結(jié)果

2.4 分離菌16S rDNA PCR 擴增分析

分離菌16S rDNA PCR 擴增產(chǎn)物，在1 500 bp左右處出現(xiàn)明顯的目的條帶（圖3）。對該株分離菌進行16S rDNA PCR 測序，并經(jīng)Blast 比對，發(fā)現(xiàn)M1 和M2 分離菌的16S rDNA 序列與S.equi同源性達100%。系統(tǒng)進化樹顯示，M1 和M2 親緣關系十分接近（圖4）。

3 討論

本研究從山東省某驢場驢腺疫病例的淋巴結(jié)膿液中分離篩選出2 株S.equi菌株。這2 株菌對氨芐西林、卡那霉素、甲氧氨芐嘧啶和四環(huán)素產(chǎn)生了不同程度的耐藥，對恩諾沙星、氯霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和美羅培南高度敏感。這表明臨床中存在抗生素濫用情況，需要加以控制。因此，當有疾病發(fā)生時，需進行快速診斷，根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果，指導臨床用藥，防止產(chǎn)生藥菌株。

圖3 2 株菌（M1、M2）16S rDNA PCR 擴增結(jié)果

圖4 2 株菌（M1、M2）核苷酸序列系統(tǒng)進化樹

本研究表明，該次驢疫病是由S.equi感染引起的。在春季，驢易感染S.equi，尤其是幼駒。因此，對此病應根據(jù)易感時期、易感季節(jié)和病畜癥狀及時作出判斷，以便及時治療，防止疫病傳播，從而減少經(jīng)濟損失[4]。

腺疫是一種細菌感染的馬屬動物上呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，感染的特點是嗜睡、厭食、發(fā)燒以及膿性鼻分泌物和周圍淋巴結(jié)病合并形成膿腫[5]，更嚴重的并發(fā)癥包括腺疫轉(zhuǎn)移和免疫反應，如肌病、腎小球腎炎和血管炎等[6-7]。隨著驢場規(guī)?；B(yǎng)殖程度的不斷提升，集約化飼養(yǎng)導致病原滋生泛濫，病原微生物多、密集度高，由此導致感染發(fā)病的幾率增多。同時在病原的相互作用下，疾病會變得將更為復雜[8]。因此，使用有效的檢疫和治療方法，防止腺疫等傳染病的傳播，對確保我國驢業(yè)的健康發(fā)展至關重要。