大腸桿菌磺胺類抗生素耐藥基因二重PCR 技術(shù)的建立

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實驗室，四川成都 610066）

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌，為腸桿菌科埃希氏菌屬，由Escherich 在1885 年發(fā)現(xiàn)。該菌大小0.5 μm×（1～3）μm，周生鞭毛，能運(yùn)動，無芽孢。絕大多數(shù)大腸桿菌對人與動物有益，但是仍有少部分特殊類型的大腸桿菌具有相當(dāng)強(qiáng)的毒力，一旦感染，可能會造成嚴(yán)重疫情[1]。

磺胺類抗生素（sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是一類用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)治療藥物[2]。它通過干擾細(xì)菌的葉酸代謝而抑制細(xì)菌的生長繁殖。細(xì)菌與藥物反復(fù)接觸后，易產(chǎn)生耐藥性，磺胺類抗生素也不例外，耐藥性嚴(yán)重影響抗生素藥物的效能。細(xì)菌對磺胺類藥物和甲氧芐啶的耐藥性與五種主要機(jī)制有關(guān)，包括：（1）通透性屏障；（2）天然不敏感的固有二氫葉酸還原酶（DHFR）；（3）與葉酸途徑有關(guān)的固有二氫葉酸合成酶（DHPS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）基因的自發(fā)突變；（4）通過上調(diào)基因表達(dá)或基因復(fù)制來增加敏感靶酶的產(chǎn)生；（5）通過整合子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座獲得替代二氫葉酸合成酶（Sul）和二氫葉酸還原酶（dfr）基因[3-4]。迄今為止，已在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌[5-8]中描述了4 種不同的Sul替代基因（Sul1，Sul2，Sul3和Sul4）和40種不同類型的dfr替代基因。因此，檢測耐藥基因?qū)τ陴B(yǎng)殖生產(chǎn)中合理用藥具有良好的指導(dǎo)意義。

對于耐藥基因檢測，目前主要有藥敏試驗[9]、PCR 檢測方法等。前者耗時耗力，花費(fèi)時間較長，而常規(guī)的PCR 檢測方法一次只能檢測一種耐藥基因。因此，本次研究旨在建立一種一次性檢測多個耐藥基因的省時省力檢測方法，便于及時在生產(chǎn)實踐中指導(dǎo)用藥，提高養(yǎng)殖效率。

1 材料與方法

1.1 所用菌株

試驗用菌株由本實驗室在生產(chǎn)豬場的廢棄物中分離，已經(jīng)過藥敏試驗鑒定具有磺胺類抗生素耐藥性。經(jīng)傳統(tǒng)PCR 檢測方法確認(rèn)，同時具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類抗生素耐藥基因的大腸桿菌作為陽性菌株。另外，選擇2 株已經(jīng)過藥敏試驗鑒定，具有磺胺類抗生素耐藥性，傳統(tǒng)PCR 檢測方法已確認(rèn)不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類抗生素耐藥基因的大腸桿菌作為特異性試驗菌株。同時選擇已經(jīng)過藥敏試驗鑒定，具有磺胺類抗生素耐藥性的沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌作為特異性試驗菌株。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

2×PCR Mix、Marker 等，均購自Tiangen 公司；其他試劑均為分析純。

1.3 引物

根據(jù)Domínguez 等[10]研究成果，針對大腸桿菌Sul1和dfrA1兩個基因各設(shè)計一對引物（表1），由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.4 PCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，模板1 μL，兩種上、下游引物各0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 敏感性試驗

對試驗用陽性大腸桿菌進(jìn)行平板計數(shù)，計算大腸桿菌濃度。取原液，分別進(jìn)行10-1～10-5稀釋，每個稀釋度樣品各1 μL 作為模板敏感性檢測。

1.6 特異性試驗

將傳統(tǒng)PCR 檢測方法確認(rèn)，不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類抗生素耐藥基因的2 株大腸桿菌和已經(jīng)過藥敏試驗鑒定，具有磺胺類抗生素耐藥性的沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌作為模板進(jìn)行特異性檢測。

2 結(jié)果

2.1 有效性

通過對3 株試驗用大腸桿菌檢測發(fā)現(xiàn)，本方法能順利地檢測出Sul1和dfrA1兩種磺胺類抗生素耐藥基因（圖1）。

圖1 二重PCR 檢測結(jié)果

2.2 敏感性

將試驗用陽性大腸桿菌進(jìn)行平板計數(shù)后，發(fā)現(xiàn)濃度為4.5×107cfu/mL。將其進(jìn)行10-1～10-5系列稀釋，每個稀釋度各取樣品1 μL 作為模板敏感性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-3稀釋度樣品仍出現(xiàn)兩個條帶，10-4和10-5兩個稀釋度樣品已無條帶（圖1）。這說明本方法的檢出限為4.5 cfu/μL。

2.3 特異性

將經(jīng)過藥敏試驗鑒定，具有磺胺類抗生素耐藥性，且傳統(tǒng)PCR 檢測方法已確認(rèn)不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類抗生素耐藥基因的2 株大腸桿菌作為模板進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)并不能檢出這兩種基因。同時，也不能檢出經(jīng)藥敏試驗鑒定，具有磺胺類抗生素耐藥性的沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌（圖1）。這說明本方法對于Sul1和dfrA1兩種大腸桿菌磺胺類抗生素耐藥基因具有較強(qiáng)的檢出特異性。

3 討論

目前，已有大量關(guān)于磺胺類抗生素耐藥性檢測的報道[3-5]，大多采用常規(guī)PCR 檢測方法，針對單一磺胺類抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測。這類檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確率高，在生產(chǎn)實踐中得以廣泛運(yùn)用。然而由于這些傳統(tǒng)PCR 檢測方法一次只能檢測單一磺胺類抗生素耐藥基因，對于同時檢測多種磺胺類抗生素耐藥基因，操作較為繁鎖、費(fèi)時費(fèi)力。本研究針對不同類型的兩種磺胺類抗生素耐藥基因同時檢測，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

研究中的二重PCR 檢測比傳統(tǒng)PCR 靈敏度要低一些。這可能是由于PCR 反應(yīng)的原理決定的[11-12]。PCR 反應(yīng)中，上下游引物分別結(jié)合在模板上，指導(dǎo)DNA 聚合酶啟動并依照模板完成DNA 合成。在二重PCR 反應(yīng)的反應(yīng)體系中存在多對引物，這些引物在結(jié)合模板時，相互競爭，在模板濃度較低時，多對引物競爭的結(jié)果，必然會導(dǎo)致多重PCR檢測方法的靈敏度低。

本研究采用大腸桿菌建立了磺胺類抗生素耐藥基因二重PCR 檢測方法。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，沒有細(xì)胞壁，可直接進(jìn)行菌落PCR 檢測，省去了提取DNA 的麻煩。對于其它細(xì)菌，除了個別革蘭氏陽性菌，由于存在細(xì)胞壁而不能直接進(jìn)行菌落PCR 檢測外，操作大致是相同的。但是，本方法并不能檢出沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌的磺胺耐藥基因，這可能是由于宿主細(xì)菌不同，而導(dǎo)致這些耐藥基因在DNA 序列上有少許的差異。因此只需要在引物序列上進(jìn)行必要的調(diào)整，就可以采用本方法對其它細(xì)菌進(jìn)行磺胺類抗生素耐藥基因檢測。

本研究建立的大腸桿菌磺胺類抗生素耐藥基因Sul1和dfrA1的二重PCR 檢測方法，特異性高、操作簡單方便，為檢測此類耐藥基因提供了有力的技術(shù)支持。